人結(jié)腸癌羥基喜樹堿多藥耐藥的分子機(jī)制研究.pdf

1、目的：為結(jié)腸癌多藥耐藥研究建立實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ?，進(jìn)一步研究消化道腫瘤的多藥耐藥機(jī)制。 方法：應(yīng)用藥物濃度遞增法建立人結(jié)腸癌羥基喜樹堿耐藥細(xì)胞株Swll16／HCPT：細(xì)胞計數(shù)法測定細(xì)胞生長曲線；四唑藍(lán)(MTT)比色法進(jìn)行體外藥物敏感實(shí)驗(yàn)；流式細(xì)胞儀測定細(xì)胞周期分布；細(xì)胞染色體染色進(jìn)行核型分析；聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)一酶聯(lián)免疫吸附測定(ELISA)檢測細(xì)胞端粒酶活性。 結(jié)果：SWlll6／HCPT與親代細(xì)胞相比，光鏡下形態(tài)未發(fā)生明

2、顯改變，生長曲線無明顯改變；體外藥物敏感實(shí)驗(yàn)顯示：耐藥細(xì)胞對HCPT的耐藥倍數(shù)增加120倍，對阿霉素耐藥倍數(shù)增加48.2倍，對氧化苦參堿耐藥倍數(shù)增加2.1倍，對阿糖胞苷耐藥倍數(shù)增加2.O倍，對5-氟尿嘧啶耐藥倍數(shù)增加1.8倍，對順鉑耐藥倍數(shù)增加1-3倍，與多種化療藥物存在交叉耐藥現(xiàn)象；細(xì)胞周期分布有明顯改變：G1期細(xì)胞增加，S期細(xì)胞減少，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)；染色體核型為：非整倍體54.69，約有600[％]-70％的細(xì)胞存

3、在4號染色體和13號染色體的易位現(xiàn)象，但是與親代細(xì)胞相比，差異無統(tǒng)計學(xué)意義；端粒酶活性無明顯改變，細(xì)胞無限增殖能力未受影響。 結(jié)論：應(yīng)用藥物濃度遞增法成功建立了人結(jié)腸癌羥基喜樹堿耐藥細(xì)胞株Swll16／HCPT，后者與多種化療藥物存在交叉耐藥現(xiàn)象。這種多藥耐藥性的改變不是因?yàn)榛虻娜笔?，而可能是因?yàn)榛虻耐蛔?，或表達(dá)量的改變所致。細(xì)胞周期的改變是腫瘤細(xì)胞對羥基喜樹堿耐藥的一種主要表現(xiàn)。人結(jié)腸癌羥基喜樹堿耐藥細(xì)胞株SWll16／H

4、CPT是研究消化道腫瘤多藥耐藥現(xiàn)象的理想模型。 目的：探討結(jié)腸癌羥基喜樹堿耐藥細(xì)胞株SWlll6／HCPT株中耐藥相關(guān)基因的表達(dá)情況，為多藥耐藥的逆轉(zhuǎn)選擇靶位點(diǎn)。 方法：抽取細(xì)胞總RNA，應(yīng)用腫瘤藥物耐受功能分類基因芯片篩選差異表達(dá)的耐藥相關(guān)基因；采用RT-PCR法對篩選出的耐藥相關(guān)基因的表達(dá)情況進(jìn)行驗(yàn)證。 結(jié)果：SWlll6／HCPT與親代細(xì)胞相比，耐藥細(xì)胞株表達(dá)改變的基因有30個，其中表達(dá)F調(diào)10個，上調(diào)20

5、個。這些表達(dá)改變的基因分別屬于藥物代謝基因、耐藥轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因、DNA修復(fù)基因、細(xì)胞周期基因、生長因子受體基因、激素受體基因、生長因子基因等。在驗(yàn)證的SWlll6／HCPT細(xì)胞8個耐藥相關(guān)基因中，2個(CYPlA2、PPARA)表達(dá)下調(diào)，4個(APC、BRCAl、EIKl、BCRP、和P19)表達(dá)上調(diào)，還有2個(BRCAl、MDRI)表達(dá)無明顯改變，其中BCRP基因的表達(dá)改變最明顯。 結(jié)論：SWlll6／HCPT細(xì)胞中存在多種耐藥

6、相關(guān)基因表達(dá)的改變，各種耐藥轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的表達(dá)升高，細(xì)胞受損DNA的修復(fù)能力增強(qiáng)。細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶抑制物的表達(dá)升高是腫瘤細(xì)胞周期改變(G0／G1期細(xì)胞增加、S期細(xì)胞減少)的主要原因。BCRP基因在耐藥細(xì)胞中表達(dá)升高近90倍，選擇它作為逆轉(zhuǎn)耐藥的靶位點(diǎn)。 目的：探討結(jié)腸癌羥基喜樹堿多藥耐藥現(xiàn)象的逆轉(zhuǎn)策略。 方法：構(gòu)建BCRP基因siRNA表達(dá)質(zhì)粒，并用脂質(zhì)體法轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)腸癌羥基喜樹堿剛藥細(xì)胞；四唑藍(lán)(MTT)比色法進(jìn)行體外藥

7、物敏感實(shí)驗(yàn)；流式細(xì)胞儀測定細(xì)胞周期分布；軟瓊脂克隆形成實(shí)驗(yàn)檢測腫瘤細(xì)胞體外成瘤性；RT-PCR和westen B1Ot法測定BCRP基因敲除效果。 結(jié)果：成功構(gòu)建BCRP基因siRNA表達(dá)質(zhì)粒，脂質(zhì)體法導(dǎo)入結(jié)腸癌羥基喜樹堿耐藥細(xì)胞，轉(zhuǎn)染效率約42％；與耐藥細(xì)胞相比，轉(zhuǎn)染細(xì)胞對HCPT敏感性增加，IC<,50>下降62.5％，部分逆轉(zhuǎn)了耐藥；轉(zhuǎn)染細(xì)胞周期分布有明顯改變：G1期細(xì)胞減少，S期細(xì)胞增加；轉(zhuǎn)染細(xì)胞體外成瘤性下降，形成克

8、隆體積減?。籖T-PCR和Western Blot顯示，轉(zhuǎn)染細(xì)胞中BCRP基因mRNA和蛋白質(zhì)的表達(dá)下降甚至消失。 結(jié)論：siRNA表達(dá)質(zhì)粒可以有效敲除BCRP基因的表達(dá)，從而降低BCRP轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的水平。降低耐藥轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的水平可以部分恢復(fù)SWlll6／HCPT細(xì)胞對羥基喜樹堿的敏感性，并降低腫瘤細(xì)胞的體外成瘤性。siRNA表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)導(dǎo)是逆轉(zhuǎn)結(jié)腸癌羥基喜樹堿耐藥現(xiàn)象的一種有效手段。 目的：對結(jié)腸癌羥基喜樹堿多藥耐藥細(xì)胞(

9、SWlll6/HCPT)及其親代細(xì)胞(SWll 16)進(jìn)行比較蛋白質(zhì)組學(xué)研究，探討耐藥相關(guān)蛋白的差異表達(dá)情況，深入研究腫瘤細(xì)胞的多藥耐藥機(jī)制。 方法：培養(yǎng)羥基喜樹堿多藥耐藥細(xì)胞和親代細(xì)胞，提取蛋白質(zhì)，以固相pH梯度等電聚焦為第一向，SDS-PAGE垂直電泳為第二向進(jìn)行雙向電泳(2-DE)，圖像分析軟件分析電泳圖譜，MALDI-TOF質(zhì)譜或MALDI-TOF/TOF串聯(lián)質(zhì)譜鑒定蛋白質(zhì)。 結(jié)果：發(fā)現(xiàn)9個蛋白質(zhì)點(diǎn)在SWlll

10、6/HCPT細(xì)胞中表達(dá)量發(fā)生改變，4個蛋白質(zhì)點(diǎn)表達(dá)量增加，5個蛋白質(zhì)點(diǎn)表達(dá)量減少。以質(zhì)譜鑒定了6個蛋白質(zhì)點(diǎn)分別為：琥珀酸脫氫酶復(fù)合物(亞單位A)、3-磷酸甘油醛脫氫酶、泛素融合降解1相似蛋白、胞核氯離子通道蛋白、β-微管蛋白和ORF蛋白。 結(jié)論：結(jié)腸癌羥基喜樹堿多藥耐藥細(xì)胞(Swll 16/HCPT)內(nèi)存在多種耐藥相關(guān)蛋白的差異表達(dá)。耐藥細(xì)胞中無氧酵解作用減弱，線粒體有氧呼吸作用增強(qiáng)，泛素依賴性蛋白降解過程活躍。耐藥細(xì)胞的細(xì)胞周