羥基喜樹堿誘導(dǎo)人膀胱癌細(xì)胞凋亡及其機(jī)制的研究.pdf

1、目的：膀胱癌是人類常見惡性腫瘤之一，嚴(yán)重威脅著人們的生命和健康。膀胱癌在我國泌尿系腫瘤中的發(fā)病率占第1位，復(fù)發(fā)率高是其顯著特點(diǎn)，因此絕大多數(shù)患者在進(jìn)行腫瘤切除手術(shù)后需進(jìn)行膀胱灌注化療。為了尋找一種更為有效的灌注化療藥物，國內(nèi)外學(xué)者都在進(jìn)行不懈的努力。羥基喜樹堿(HCPT)是從珙桐科植物喜樹中提取得到的生物堿，從上世紀(jì)80年代開始應(yīng)用于膀胱癌灌注化療，并成為臨床上進(jìn)行膀胱癌化療常用的藥物之一，但其抗癌作用機(jī)制目前、尚不十分清楚。近年研究發(fā)

2、現(xiàn)，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡是HCPT發(fā)揮抗腫瘤作用的重要機(jī)制。Bcl-2基因是Bcl-2基因家族中最早被發(fā)現(xiàn)，也是最重要的抗凋亡基因。有研究發(fā)現(xiàn)，很多凋亡刺激因素誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡過程中，伴有Bcl-2蛋白表達(dá)水平的下調(diào)。降低Bcl-2蛋白表達(dá)水平可能是凋亡刺激因素誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的重要機(jī)制。 本研究應(yīng)用HCPT作用于體外培養(yǎng)的人膀胱癌T24．細(xì)胞，觀察其作用效果，并檢測藥物作用后人膀胱癌1-24細(xì)胞的Bcl-2蛋白的表達(dá)水平，探討羥基喜樹堿對(duì)人膀

3、胱癌T24細(xì)胞的凋亡誘導(dǎo)作用及其機(jī)制，深入研究羥基喜樹堿的生物學(xué)作用及其機(jī)制對(duì)膀胱癌的治療具有重要的意義。 方法: 一、MTT法檢測細(xì)胞存活率對(duì)數(shù)生長期人膀胱癌T24細(xì)胞調(diào)整細(xì)胞濃度為1×10<'5>個(gè)/ml，接種于96孔培養(yǎng)板，24 h后加入終濃度分別為0.01、0.1、1、10μg/ml的羥基喜樹堿，對(duì)照組加入等體積10％的1640培養(yǎng)液，每個(gè)濃度設(shè)6個(gè)平行孔。繼續(xù)培養(yǎng)48 h，MTT法檢測細(xì)胞存活率。 二、

4、TUNEL法人膀胱癌T24.細(xì)胞接種于蓋玻片上，設(shè)對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組，實(shí)驗(yàn)組采用1μg/ml羥基喜樹堿處理48小時(shí)。從六孔板內(nèi)取出蓋玻片后，按照試劑盒說明書操作，每個(gè)濃度重復(fù)3次，200倍光學(xué)顯微鏡下觀察。每張蓋玻片上隨機(jī)計(jì)數(shù)500個(gè)細(xì)胞，計(jì)數(shù)凋亡細(xì)胞數(shù)占細(xì)胞總數(shù)的比率，即凋亡指數(shù)(apoptosis index，AI)，計(jì)算公式：AI(％)=(凋亡細(xì)胞數(shù)/500)×100％。 三、流式細(xì)胞儀(FCM)檢測細(xì)胞凋亡率對(duì)數(shù)生長期人膀胱

5、癌T24細(xì)胞調(diào)整細(xì)胞濃度為1×10<'5>個(gè)/ml，接種于25cm<'2>細(xì)胞培養(yǎng)瓶，24小時(shí)細(xì)胞80％左右融合，收集對(duì)照組和分別經(jīng)0.01、0.1、1、10μg/ml的羥基喜樹堿處理48 h的人膀胱癌T24細(xì)胞，PI單染后流式細(xì)胞儀下檢測。每個(gè)濃度重復(fù)3次，每次計(jì)數(shù)10<'4>個(gè)細(xì)胞。采用CELL QuEST軟件進(jìn)行DNA含量分析，以G<,0>/G<,1>峰前出現(xiàn)的亞二倍體細(xì)胞數(shù)量占細(xì)胞總數(shù)的百分率表示凋亡率。 四、Wlest

6、ern Blot檢測Bcl-2蛋白含量變化收集對(duì)照組和羥基喜樹堿(1μg/ml)處理48 h的人膀胱癌T24細(xì)胞，提取細(xì)胞總蛋白。酚試劑法對(duì)提取的蛋白樣品進(jìn)行定量。細(xì)胞總蛋白作Bcl-2蛋白含量分析。 每個(gè)樣本重復(fù)3遍。細(xì)胞總蛋白以β-actin作內(nèi)參照。采用Fluorchem v2.0凝膠成像分析軟件(美國Alpha公司)對(duì)條帶進(jìn)行灰度掃描，以平均灰度和條帶面積的乘積代表信號(hào)強(qiáng)度，以目的條帶和內(nèi)參照灰度的比值表示蛋白含量。