喜樹堿誘導甜菜夜蛾細胞凋亡的線粒體途徑及機理研究.pdf

1、線粒體在細胞凋亡中占據(jù)重要地位，但線粒體在昆蟲細胞凋亡中的作用還鮮有研究。我們課題組在研究喜樹堿(camptothecin，CPT)的作用機制的過程中發(fā)現(xiàn)其可能通過誘導昆蟲細胞凋亡而起到殺蟲作用，而此過程中涉及線粒體的參與。但線粒體是如何參與CPT誘導的昆蟲細胞凋亡過程以及線粒體與昆蟲細胞凋亡的關系還不得而知。為了進一步闡明CPT與HCPT誘導的線粒體途徑以及CPT及羥基喜樹堿(10-hydroxycamptothecin，HCPT)的

2、毒理學機制，我們研究了CPT和HCPT對甜菜夜蛾（Spodoptera exigua）中腸脂肪體細胞系IOZCAS-Spex-Ⅱ的凋亡誘導效應、凋亡過程中線粒體形態(tài)結構與功能的改變及改變機制，得到如下研究結果:
　　通過PI/AnnexinⅤ-FITC雙染法檢測了CPT和HCPT誘導的IOZCAS-Spex-Ⅱ細胞凋亡隨藥劑處理時間和處理濃度的變化。發(fā)現(xiàn)CPT和HCPT均可顯著地誘導細胞發(fā)生凋亡，具有時間和濃度依賴效應。CPT和H

3、CPT處理24 h，細胞凋亡率分別為53.57％和51.46％，MTT法檢測細胞活性抑制率分別為53.13％和54.85％，表明細胞凋亡率與細胞活性抑制率的變化基本一致，表明CPT和HCPT通過誘導甜菜夜蛾細胞凋亡而導致其增殖活性受到抑制。
　　通過透射電鏡觀察了線粒體的亞顯微結構，線粒體在CPT和HCPT刺激2h后即出現(xiàn)腫脹變圓，嵴彎曲，24h后線粒體分裂大量增多，線粒體外膜破裂。同時伴隨著細胞核固縮，染色質凝集，吞噬小泡增多等

4、凋亡現(xiàn)象。激光共聚焦顯微鏡觀察線粒體的分布，線粒體隨著藥劑處理時間的延長，線粒體去極化，分布狀態(tài)也由均勻分布向簇狀、彌散狀轉化。表明CPT和HCPT能夠引起昆蟲細胞線粒體形態(tài)、結構和分布的改變。
　　通過流式細胞儀檢測線粒體膜電位、氧化自由基(reactive oxygen species，ROS)、鈣(calcium，Ca2+)，等線粒體功能指標。CPT和HCPT處理后，早期ROS產(chǎn)生增多，12h左右降至最低，以后又大量產(chǎn)生，證

5、明了ROS產(chǎn)生是個鏈式連鎖放大反應。胞質Ca2+濃度增大，6-12 h增加最為顯著。而線粒體膜電位則一直處于下降趨勢，且在藥劑處理12h開始急劇下降。在選擇濃度范圍內(nèi)，隨著處理濃度的增大，ROS產(chǎn)生逐漸增多，線粒體膜電位的喪失增加，胞質Ca2+濃度逐漸增大。表明CPT和HCPT引起的昆蟲細胞線粒體功能改變具有時間和濃度效應。同時12h是線粒體發(fā)揮功能的一個關鍵時間點，線粒體在接收凋亡刺激后，產(chǎn)生大量的ROS，胞質Ca2+釋放，線粒體膜電

6、位降低，線粒體膜通透化，進而刺激產(chǎn)生更多ROS，促進凋亡發(fā)生。
　　通過加入線粒體通透性轉換孔(mitochondrial permeablity transition pore，mPTP)的抑制劑環(huán)孢菌素A(CyclosporineA，CsA)，研究線粒體內(nèi)膜通透化轉換在CPT和HCPT誘導昆蟲細胞凋亡中的作用。發(fā)現(xiàn)CsA抑制了CPT和HCPT誘導的昆蟲細胞誘導的凋亡過程中Cytc從線粒體到胞質的釋放、ROS的產(chǎn)生、膜電勢的喪失

7、以及胞質Ca2+的釋放，進而抑制細胞凋亡。證實CPT和HCPT誘導的昆蟲細胞凋亡具有線粒體通透性轉換孔依賴性，但這種依賴性具有時間性，隨著線粒體功能的改變，細胞凋亡一旦發(fā)生，將以不可逆的態(tài)勢繼續(xù)發(fā)生，表明不依賴于線粒體通透性孔開放的凋亡路徑亦同時存在。
　　通過免疫方法和分光光度法分析了CPT和HCPT誘導甜菜夜蛾細胞IOZCAS-Spex-Ⅱ過程中DNA、脂質和蛋白質的氧化狀況。研究發(fā)現(xiàn)CPT和HCPT能夠引起甜菜夜蛾細胞DNA

8、損傷，細胞脂質和蛋白質發(fā)生一定程度的氧化損傷，與對照組相比，48h氧化損傷顯著。表明CPT和HCPT對昆蟲細胞產(chǎn)生氧化壓力，產(chǎn)生過多ROS，導致昆蟲細胞DNA、脂質和蛋白都產(chǎn)生氧化損傷，細胞發(fā)生凋亡。
　　綜上所述，CPT和HCPT處理引起昆蟲細胞產(chǎn)生ROS，造成細胞DNA、脂質和蛋白質過氧化，從而對昆蟲細胞產(chǎn)生毒性。凋亡途徑為線粒體內(nèi)途徑，具有一定的線粒體通透性轉換孔開放依賴性。本論文首次系統(tǒng)地闡明了喜樹堿誘導的昆蟲細胞凋亡的機