羥基喜樹堿治療神經(jīng)母細胞瘤的研究.pdf

1、研究背景： NB是兒童期最常見的顱外實體瘤，它不但惡性程度高、侵襲力強，而且早期轉移率高、晚期病例多、治療效果差。尤其是晚期高危病例，常因對一線藥物不敏感導致耐藥復發(fā)，長期生存率很低，是制約NB患兒生存率提高的主要原因。因此積極尋找有效的二線化療藥物是提高NB患兒生存率的重要手段。HCPT是我國利用天然資源優(yōu)勢研制出的純天然生物堿抗腫瘤藥，對多種腫瘤具有較好的療效，且毒副作用較低、價格低廉。但其在小兒NB的治療作用國內外尚未見報

2、道。因此本研究通過體外實驗結合臨床治療來探討HCPT對NB的療效，為探索NB新的、有效的化療方案，提高生存率，提供理論基礎與臨床經(jīng)驗。 第一部分羥基喜樹堿對入神經(jīng)母細胞瘤SMS-KCNR細胞增殖的影響 目的： 研究HCPT在體外對人NB細胞系SMS-KCNR細胞增殖和細胞周期的影響。 方法： 采用MTT法觀察不同濃度的HCPT(2.5～200nM)作用不同時間(24h、48h、72h)后對SMS-

3、KCNR細胞增殖的影響。同時應用平板集落形成試驗觀察不同濃度的HCPT(2.5nM、5nM、7.5nM、10nM、20nM)對SMS-KCNR細胞集落形成的影響。用不同濃度的HCPT(2.5nM、5nM、10nM、20nM)作用SMS-KCNR細胞24h及48h，碘化丙錠(PI)染色后用流式細胞儀檢測并分析細胞周期的改變。 結果： 1.HCPT能顯著抑制SMS-KCNR細胞增殖，并隨藥物濃度的升高和作用時間的延長而抑制作

4、用增強，呈明顯濃度和時間依賴性。 2.在HCPT(2.5～200nM)作用24h及48h后SMS-KCNR細胞增殖抑制率分別為3.6～64.7％、12.5～91.7％，而2.5～20nM濃度范圍HCPT作用72h的抑制率為36.7～97％。 3.HCPT能明顯抑制SMS-KCNR細胞集落形成，濃度為10nM和20nM時能完全抑制其集落形成。 4.經(jīng)流式細胞儀檢測，不同濃度HCPT(2.5nM、5nM、10nM、2

5、0nM)作用SMS-KCNR細胞24h，使細胞周期阻滯于S期；作用48h使細胞周期阻滯于G2/M期。 結論： HCPT能顯著抑制SMS-KCNR細胞增殖和集落形成，其抑制作用呈時間和劑量依賴性。HCPT作用SMS-KCNR細胞24h及48h，分別使細胞周期阻滯于S期及G2/M期。 第二部分羥基喜樹堿對人神經(jīng)母細胞瘤SMS-KCNR細胞凋亡的影響 目的： 研究HCPT在體外對人NB細胞系SMS-KC

6、NR細胞凋亡的誘導作用，并探討其誘導凋亡的信號轉導機制，證實HCPT對SMS-KCNR增殖抑制作用是誘導細胞凋亡的結果。 方法： 用光學顯微鏡及DAPI染色熒光顯微鏡觀察HCPT作用48h后SMS-KCNR細胞出現(xiàn)的凋亡形態(tài)學改變。用瓊脂糖凝膠電泳檢測DNALadder的形成。用流式細胞儀(AnnexinV和PI雙染法)檢測細胞凋亡率的變化。采用Westernblot檢測不同濃度HCPT(2.5nM、5nM、10nM、2

7、0nM)作用SMS-KCNR細胞48h后線粒體凋亡途徑中P53、Bcl-2、Bax、cytochromec、caspase-3及PARP蛋白表達水平的變化。 結果： 1.不同濃度HCPT(2.5nM、5nM、10nM、20nM)作用SMS-KCNR細胞48h后能明顯誘導細胞凋亡，凋亡的誘導作用呈劑量依賴性。 2.光學顯微鏡顯示不同濃度HCPT(2.5nM、5nM、10nM、20nM)作用SMS-KCNR細胞48h

8、后使細胞密度呈劑量依賴性降低。DAPI染色熒光顯微鏡下觀察到典型的凋亡小體形成。瓊脂糖凝膠電泳檢測到明顯的DNA梯形條帶(DNAladder)。 3.流式細胞儀(AnnexinV和PI雙染法)檢測顯示HCPT作用SMS-KCNR細胞48h后細胞凋亡率呈劑量依賴性增加。在2.5～20nM的HCPT作用48h后，早期凋亡細胞分別為12.22～50.78％，晚期凋亡細胞分別為8.67～67.32％，總凋亡細胞分別為20.89～97.6

9、6％，明顯高于對照組(分別為4.15％、0.13％、4.28％)。 4.HCPT(2.5～20nM)作用于SMS-KCNR細胞48h后，隨作用濃度的增加，P53表達逐漸增高，呈顯著的濃度依賴性。 5.HCPT(2.5～20nM)作用于SMS-KCNR細胞48h后，Bcl-2、Bax表達水平、Bax/Bcl-2比值未見改變。 6.HCPT(2.5～20nM)作用于SMS-KCNR細胞48h后，隨作用濃度的增加，胞質

10、cytochromec表達逐漸增高，線粒體cytochromec表達逐漸降低，呈顯著的濃度依賴性。 7.HCPT(2.5～20nM)作用于SMS-KCNR細胞48h后，caspase-3被激活，procaspase-3表達逐漸減少，有活性的17kDa亞基表達逐漸增加，呈顯著的濃度依賴性。 8.HCPT(2.5～20nM)作用于SMS-KCNR細胞48h后，PARP被激活，89kDa的裂解片段表達逐漸增加，呈顯著的濃度依賴

11、性。 結論： HCPT能誘導SMS-KCNR細胞凋亡，凋亡的誘導作用呈顯著劑量依賴性。HCPT通過P53介導的線粒體凋亡途徑，誘導cytochromec釋放，并最終通過激活caspase-3及PARP促使細胞凋亡。HCPT有臨床應用治療NB的可行性。 第三部分羥基喜樹堿治療復發(fā)和難治性神經(jīng)母細胞瘤的療效觀察 目的： 復發(fā)和難治性NB療效差，生存時間短，死亡率高。HCPT是純天然生物堿抗腫瘤藥，對多

12、種腫瘤有較好療效，但它在NB的治療作用國內外尚未見報道。本部分在體外預實驗的基礎上應用HCPT治療復發(fā)和難治性NB，探討其療效。 方法： 10例復發(fā)和2例難治性NB患兒接受HCPT化療，其中5例復發(fā)患兒接受HCPT單藥治療，余7例患兒接受HCPT聯(lián)合治療。HCPT單藥治療用法：7.5mg/m2，靜脈滴注，d1～14；HCPT聯(lián)合化療采用改良新A1與改良B方案交替應用。改良新A1方案：CTX1200mg/m2d1、VP16

13、100mg/m2d1～5、HCPT5mg/m2d1～3、CDDP90mg/m2d4；改良B方案：IFO1.5g/m2d1～5、HCPTSmg/m2d1～3、CBP450mg/m2d2，均采用靜脈滴注。 結果： 部分緩解4例(33.3％)，疾病穩(wěn)定8例(66.7％)。有效患者中位緩解時間3.5(2～5)個月。HCPT單藥治療不良反應輕微，HCPT聯(lián)合化療的主要不良反應為骨髓抑制及消化道反應，無化療相關的死亡。 結論