膀胱癌細胞表達IgG及其抗體、反義核酸誘導(dǎo)腫瘤細胞凋亡的研究.pdf

1、傳統(tǒng)免疫學(xué)理論認為，免疫球蛋白(Immunoglobulin，Ig)基因僅在B淋巴細胞發(fā)育過程中進行選擇性重排，其它體細胞不能產(chǎn)生Ig基因重排，故免疫球蛋白是B淋巴細胞的特征性產(chǎn)物。近年來，邱曉彥等通過免疫組化、Western blot等研究發(fā)現(xiàn)，多種上皮性惡性腫瘤細胞、增生活躍的上皮細胞及鄰近癌組織相對的正常上皮細胞的胞漿中存在與免疫球蛋白抗原性相同且分子結(jié)構(gòu)相似的蛋白質(zhì)分子，但其他正常上皮細胞均為陰性反應(yīng)。隨后，其它學(xué)者等也分別用免

2、疫組化及Western blot等方法發(fā)現(xiàn)人乳腺癌細胞MCF-7和MDA-MB-231、人喉癌細胞Hep-2、胃癌細胞等上皮來源的癌細胞存在Ig(重鏈或輕鏈)免疫反應(yīng)陽性物質(zhì)。其后，邱曉彥等又分別從蛋白質(zhì)水平和mRNA水平證實IgG在非B細胞來源的腫瘤細胞中表達，并提出癌細胞來源的Ig具有生長因子樣活性。因此，探討IgG在癌細胞中的表達將為癌變機理提供新的理論依據(jù)，進而為腫瘤治療提供一個新的途徑。為此，本文研究了膀胱移行上皮細胞癌中Ig

3、G表達，并進一步研究其在腫瘤發(fā)生發(fā)展過程中的生物學(xué)效應(yīng)及作用機制。 第一部分膀胱移行細胞癌患者癌組織中IgG的表達及其臨床意義。 目的：探討免疫球蛋白IgG在臨床膀胱移行細胞癌患者癌(BTCC)組織中的表達及其臨床意義。 方法：收集2005年7月～2006年6月在中山大學(xué)附屬第一醫(yī)院和中山大學(xué)腫瘤醫(yī)院泌尿外科住院，并行開放手術(shù)或經(jīng)尿道切除膀胱腫瘤治療，手術(shù)后病理檢查證實為膀胱移行上皮細胞癌(BTCC)組織標本56

4、例。其中男47例，女9例，年齡22～86歲，平均60.1歲，中位年齡62歲。按WHO病理分級：G1 19例，G2 21例，G3 16例。淺表性腫瘤(Tis、Ta、T1)42例，浸潤性腫瘤(T2、T3、T4)14例。另取同期11例正常膀胱粘膜標本作對照，此11例標本均來自于同期因浸潤性膀胱癌而行膀胱全切術(shù)的患者，均為腫瘤局部浸潤生長者，取其全切后的膀胱，在離癌腫邊緣2cm以外的正常膀胱粘膜取標本。采用免疫組織化學(xué)和原位雜交法檢測56例BT

5、CC組織及11例正常膀胱組織中IgG和CD20蛋白及IgG1 mRNA的表達。 結(jié)果：免疫組化顯示BTCC組織中IgG蛋白陽性表達率為91.1﹪(51/56)，陽性染色強度為++～++++；正常膀胱移行上皮細胞胞漿中IgG蛋白的表達為45.4﹪(5/11)，陽性染色強度多較輕，為+～++。組間比較差異比較有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。G1、G2和G3期BTCC組織中IgG蛋白的表達率分別為84.2﹪(16/19)、90.5﹪(1

6、9/21)和100﹪(16/1 6)，組間比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。BTCC癌細胞胞漿中CD20表達為陰性，而癌組織血管中的B淋巴細胞則成陽性染色，排除了癌組織中可能浸潤的B淋巴細胞。免疫組化BTCC組織IgG蛋白表達較強的區(qū)域，原位雜交顯示IgG1的mRNA的表達也較強，二者表達基本一致。 結(jié)論：BTCC細胞能夠表達IgG，但與腫瘤的分級無關(guān)，提示IgG的產(chǎn)生可能與BTCC的生長存在一定相關(guān)性，調(diào)控IgG的表達可能

7、有利于預(yù)防BTCC的發(fā)生。 第二部分膀胱癌細胞系中IgG的表達及其抗體誘導(dǎo)腫瘤細胞凋亡的研究。 目的：研究IgG在膀胱癌細胞系T24和BU-87中的表達以及抗人IgG抗體和MMC聯(lián)合應(yīng)用對人膀胱癌細胞的作用效果及其機制。 方法：對體外培養(yǎng)的膀胱癌細胞系T24和BU-87采用免疫組織化學(xué)、Western blot、ELISA法和流式細胞術(shù)(FCM)檢測IgG蛋白的表達，采用原位雜交法和RT-PCR檢測IgG1 mR

8、NA的表達，采用噻唑藍(MTT)法檢測羊抗人IgG抗體對腫瘤細胞的生長抑制的影響，F(xiàn)CM檢測羊抗人IgG抗體誘導(dǎo)腫瘤細胞凋亡效應(yīng)。將抗人IgG體和MMC單獨或聯(lián)合作用于人膀胱癌T24細胞后，MTT法檢測腫瘤細胞的生長抑制率，F(xiàn)CM檢測T24細胞的凋亡率，Wsetem blot檢測Caspase.3和PARP剪切片段的表達。用種植T24細胞的裸鼠進行抗人IgG抗體和MMC的體內(nèi)抗瘤實驗。 結(jié)果：免疫組化顯示T24和BIU-87細胞

9、漿@IgG蛋白明顯陽性表達；Western blot表明T24和BIU-87細胞中均有IgG蛋白表達；FCM則表明IgG蛋白主要在細胞質(zhì)內(nèi)表達，細胞膜上則小部分表達；ELISA法則在T24和BIU-87細胞培養(yǎng)液的上清液中未能檢測到IgG蛋白，表明其是非分泌型的IgG蛋白。MTT顯示羊IgG和羊抗人IgG抗體在25μg/ml時對T24和BIU-87細胞的生長抑制率分別為(4.73±3.73)﹪、(24.98+3.81)﹪和(5.36+1

10、.53)﹪、(22.7±3.72)﹪，差異有顯著性(P<0.05)。在與MMC聯(lián)合應(yīng)用時，MTT法顯示羊IgG、羊抗人IgG抗體、MMC、MMC+羊IgG和MMC+羊抗人IgG抗體聯(lián)用72h體外對T24細胞生長抑制率分別為(7.16±4.99)﹪、(25.02±6.71)﹪、(32.31±6.46)﹪、(35.87±6.46)﹪和(73.66+5.81)﹪，提示MMC與抗人IgG抗體聯(lián)用抑制T24生長具有協(xié)同作用，后四組與羊IgG組相比

11、差異有顯著性(P<0.05)。FCM顯示羊抗人IgG抗體和羊IgG在25μg/ml時對BIU-87細胞的凋亡率分別為15.3﹪、1.3﹪。FCM分析顯示PBS、25μg/ml羊IgG、25 μg/ml羊抗人IgG抗體、2.0ug/ml MMC、2.0ug/ml MMC+25gg/ml羊IgG和2.0ug/ml MMC+25μg/ml羊抗人IgG抗體處理T24細胞72h后細胞凋亡率分別為1.7﹪、2.3﹪、20.7﹪、22.4﹪、28.3

12、﹪和53.8﹪。裸鼠體內(nèi)實驗顯示羊IgG組、羊抗人IgG抗體組、MMC組和MMC+羊抗人IgG抗體組抑瘤率分別為2.31﹪、12.73﹪、36.81﹪和50.51﹪。HE切片見PBS組和羊IgG組移植瘤細胞基本無凋亡和壞死，羊抗人IgG抗體組腫瘤細胞凋亡和壞死較多，MMC組和MMC+羊抗人IgG抗體組腫瘤細胞則見大量腫瘤細胞凋亡和壞死。Western blot顯示羊抗人IgG抗體、MMC、MMC+羊IgG和MMC+羊抗人IgG抗體處理T

13、24細胞72小時后出現(xiàn)明顯的17KD的caspase-3和85KD的PARP剪切片段，表明羊抗人IgG抗體和絲裂霉素(MMC)是通過激活Caspase-3途徑促進T24細胞產(chǎn)生凋亡效應(yīng)。 結(jié)論：膀胱癌細胞系T24和BIU-87能夠表達IgG，但其為非分泌型IgG。IgG的抗體對腫瘤膀胱腫瘤細胞的生長具有一定抑制作用，且其是通過激活Caspase-3途徑促進腫瘤細胞凋亡；抗人IgG抗體和MMC聯(lián)合應(yīng)用對促進膀胱癌細胞凋亡具有一定協(xié)

14、同效應(yīng)，這可能對膀胱腫瘤的治療提供一個新的靶點。 第三部分反義IgG寡核酸誘導(dǎo)膀胱腫瘤細胞T24凋亡及其作用機制的研究。 目的：了解IgG反義寡核苷酸誘導(dǎo)T24細胞凋亡以及增強膀胱癌T24細胞對絲裂霉素C(MMC)敏感性的作用及其機制。 方法：將IgG反義寡核苷酸(ASODN)和MMC單獨或聯(lián)合作用于人膀胱癌T24細胞后， MTT法檢測腫瘤細胞的生長抑制率，F(xiàn)CM檢測T24細胞的凋亡率，Western blot檢

15、測Caspase-3和PARP剪切片段的表達。以無義寡核苷酸(RODN)處理及未處理T24細胞為對照。 結(jié)果：MTT法顯示PBS組、RODN(5μM)組和3個不同濃度ASODN組(2.5μM、5μM、10μM)對T24細胞72h生長抑制率分別為(3.24±4.47)﹪、(7.61±3.69)﹪和(16.01±8.00)﹪、(20.44±7.81)﹪、(24.87±7.98)﹪；ASODN組(5μM、10μM)均高于RODN組，(

16、P<0.05)。ASODN和MMC聯(lián)合應(yīng)用時PBS組、RODN(5μM)、ASODN組(10μM)、RODN組(5μM)+MMC(終濃度為0.8ug/ml)、ASODN組(10μM)+MMC(終濃度為0.8ug/ml)對T24細胞生長抑制率分別為(4.37±10.39)﹪，(7.08±5.20)﹪和(21.49±9.20)﹪、(34.26±6.62)﹪、(39.22±6.20)﹪、(61.44±5.94)﹪。后三組與PBS和RODN組相

17、比顯著差異(P<0.05)。FCM分析顯示PBS組、RODN(10gM)組和3個不同濃度ASODN組(2.5μM、5μM、10μM)、MMC、RODN組(5μM)+MMC(終濃度為2.0ug/ml)、ASODN組(10μM)+MMC(終濃度為2.0ug/ml)對T24細胞72h后細胞凋亡率分別為2.7﹪、5.2﹪、13.0﹪、16.2﹪、17.7﹪，22.8﹪、28.5﹪和47.4﹪。提示ASODN能夠增強T24細胞對MMC誘導(dǎo)凋亡的效