神經(jīng)酰胺誘導(dǎo)膀胱癌細(xì)胞凋亡的機(jī)制研究及其與絲裂霉素C聯(lián)合應(yīng)用的效果分析.pdf

1、本研究共分三個(gè)部分論述了神經(jīng)酰胺誘導(dǎo)膀胱癌細(xì)胞凋亡的機(jī)制研究及其與絲裂霉素C聯(lián)合應(yīng)用的效果分析。首先，探討神經(jīng)酰胺對(duì)人膀胱癌細(xì)胞的凋亡誘導(dǎo)作用及其可能的分子機(jī)制；然后，以絲裂霉素C(MMC)為代表檢測(cè)化療藥物與神經(jīng)酰胺聯(lián)合應(yīng)用是否可以協(xié)同抑制人膀胱癌細(xì)胞生長(zhǎng)；最后，探討MMC與神經(jīng)酰胺發(fā)揮協(xié)同抑瘤作用的機(jī)制。 研究材料與方法： 1、C<,2>-神經(jīng)酰胺(C<,2>-Cer)對(duì)BIU-87細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制作用C<,2>-Ce

2、r處理BIU-87細(xì)胞，然后采用四甲基偶氮唑蘭(MTT)法測(cè)定細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制率，抑制率=[(對(duì)照組A<,490>值-加藥組A<,490>值)/對(duì)照組A<,490>值]x100％。 2、協(xié)同效應(yīng)檢測(cè)試驗(yàn)共分4組：(1)絲裂霉素C(MMC)組：MMC終濃度分別為11.964、23.928、47.856、95.711、191.422 μmol/L； (2)C<,2>-Cer組：C<,2>-Cer終濃度分別為2.500、5.000、10

3、.000、20.000、40.000 μmol/L； (3)聯(lián)合用藥組：同時(shí)加入、MMC和C<,2>-Cer，終濃度分別為：11.964和2.500、23.928和5.000、47.856和10.000、95.711和20.000、191.422和40.000μmol/1； (4)未經(jīng)任何藥物處理的細(xì)胞作為對(duì)照。MTT法檢測(cè)細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率，計(jì)算公式：抑制率=[(對(duì)照組A值-試驗(yàn)組A值)/對(duì)照組A值]×100％。采用CHOU-TALALA

4、Y聯(lián)合指數(shù)法判定藥物之間相互作用的效果。 3、細(xì)胞凋亡形態(tài)學(xué)檢測(cè)收集經(jīng)不同濃度MMC和C<,2>-Cer處理后的細(xì)胞，磷酸鹽緩沖液洗2次，調(diào)整細(xì)胞濃度為1x10<'7>個(gè)/mL。吖啶橙(A0)熒光染色，熒光顯微鏡下觀察。 4、細(xì)胞凋亡率檢測(cè)收集經(jīng)不同濃度MMC和C<,2>-Cer處理后的細(xì)胞，碘化丙啶(PI)染色法用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡，采集軟件CellQuest 3.0，分析軟件ModFit，結(jié)果用百分率表示。

5、 5、Caspase-3活性檢測(cè)Caspase-3活性是依據(jù)底物DEVD-pNA被活性Caspase-3分解后產(chǎn)生的pNA單體在405nm波長(zhǎng)的吸光度(A<,405>)值與Caspase-3活性成正相關(guān)而間接測(cè)定。收集經(jīng)不同濃度MMC和C<,2>-Cer處理后的細(xì)胞按照試劑盒說明書操作，紫外分光光度計(jì)在405nm波長(zhǎng)測(cè)定A<,405>值，以。4405值大小表示Caspase．3活性。 6、細(xì)胞色素C亞細(xì)胞分布及Bcl．2蛋白表

6、達(dá)水平變化的檢測(cè)按照線粒體/細(xì)胞漿分離試劑盒說明書的步驟提取線粒體和細(xì)胞漿蛋白，參照文獻(xiàn)提取細(xì)胞總蛋白。蛋白樣品用考馬斯亮藍(lán)法進(jìn)行定量。細(xì)胞總蛋白作Bcl-2蛋白含量分析，細(xì)胞漿和線粒體蛋白作細(xì)胞色素C含量分析。以40μg蛋白上樣量進(jìn)行十二烷基磺酸鈉．聚丙烯酰胺(SDS-PAGE)凝膠電泳，轉(zhuǎn)至硝酸纖維素膜，．抗體孵育、顯色。對(duì)條帶進(jìn)行灰度掃描，以目的條帶和內(nèi)參照灰度的比值表示蛋白含量。 7、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析t檢驗(yàn)或q檢驗(yàn)。

7、研究結(jié)果： 隨C<,2>-Cer濃度增加，抑制率逐漸增加(表1-1)。抑制率與C<,2>-Cer濃度呈正相關(guān)(r=0.979，P<0.05)。C<,2>-Cer處理后，可見細(xì)胞出現(xiàn)凋亡的特征性形態(tài)學(xué)改變(圖1-1)。FCM檢測(cè)BIU-87細(xì)胞凋亡率隨C<,2>-Cer濃度增加而逐漸增加(P<0.05)(圖1-2)。隨C<,2>-Cer濃度增加，Caspase-3活性逐漸增加。對(duì)照組細(xì)胞漿內(nèi)細(xì)胞色素C表達(dá)陰性，細(xì)胞色素C僅存在于線

8、粒體內(nèi)。C<,2>-Cer處理組線粒體內(nèi)細(xì)胞色素C含量顯著低于對(duì)照組(P<0.05)，同時(shí)在細(xì)胞漿內(nèi)可檢測(cè)到細(xì)胞色素C(圖1-3)。對(duì)照組和C<,2>-Cer處理組均有：Bcl-2蛋白表達(dá)，但C<,2>-Cer處理組表達(dá)水平顯著低于對(duì)照組(P<0.05)(圖1-4)。 MMC與C<,2>-Cer單獨(dú)及聯(lián)合應(yīng)用對(duì)BIU-87細(xì)胞的生長(zhǎng)均有抑制作用，隨著藥物濃度的增加，對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制作用也增加(表2-1)。MMC、C<,2>-Ce

9、r合用時(shí)各自的中效濃度分別是單用時(shí)的35.0％和40.6％。MMC和C<,2>-Cer單獨(dú)應(yīng)用時(shí)的中效方程分別是：D=153.003(fa/fu)<'0.771>和D=26.644(fa/fu)<'0.649>·649，MMC和C<,2>-Cer聯(lián)合應(yīng)用時(shí)的中效方程分別是：D=54.325(fa/fu)<'0.665>和D=11.350(fa/fu)<'0.665>。在整個(gè)效應(yīng)范圍內(nèi)兩種藥物均存在協(xié)同效應(yīng)(CI<1) (表2-2、圖2-

10、1)。 兩種藥物在各濃度聯(lián)合應(yīng)用時(shí)的凋亡率均高于各自單用，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05) (表3-1、圖3-1、3-2)。MMC、C<,2>-Cer單用和聯(lián)合應(yīng)用均可見部分細(xì)胞出現(xiàn)體積縮小，細(xì)胞核染色質(zhì)固縮、聚集于核膜下或碎裂成數(shù)個(gè)黃綠色強(qiáng)熒光顆粒等凋亡的特征性形態(tài)學(xué)改變，聯(lián)合用藥表現(xiàn)最為明顯(圖3-3)。MMC、C<,2>-Cer單獨(dú)和聯(lián)合應(yīng)用均可導(dǎo)致Caspase-3活性升高，聯(lián)合用藥Caspase-3活性升高更為明顯(P

11、<0.05)。 MMC、C<,2>-Cer單獨(dú)及聯(lián)合應(yīng)用均可使線粒體內(nèi)細(xì)胞色素C向細(xì)胞漿釋放，導(dǎo)致線粒體內(nèi)細(xì)胞色素C含量下降，MMC、C<,2>-Cer單獨(dú)及聯(lián)合用藥時(shí)，BIU-87細(xì)胞線粒體細(xì)胞色素C含量均顯著低于對(duì)照組(P均<0.05)，聯(lián)合用藥時(shí)線粒體細(xì)胞色素C含量顯著低于MMC和C<,2>-Cer單獨(dú)應(yīng)用(P均<0.05)(圖3-4)。對(duì)照組細(xì)胞漿內(nèi)細(xì)胞色素C陰性，MMC、C<,2>-Cer單獨(dú)及聯(lián)合用藥細(xì)胞漿內(nèi)均有細(xì)胞色素C出

12、現(xiàn)，聯(lián)合用藥時(shí)細(xì)胞漿內(nèi)細(xì)胞色素C含量顯著高于MMC和C<,2>-Cer單獨(dú)應(yīng)用(P均<0.05) (圖3-5)。 研究結(jié)論： 1、降低抗凋亡蛋白Bcl-2的表達(dá)水平、促進(jìn)線粒體內(nèi)細(xì)胞色素C向細(xì)胞漿的釋放和Caspase-3的激活可能是C<,2>-Cer誘導(dǎo)膀胱癌細(xì)胞凋亡的重要機(jī)制。 2、MMC與C<,2>-Cer聯(lián)合應(yīng)用可以通過共同誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，協(xié)同抑制膀胱癌細(xì)胞生長(zhǎng)。 3、線粒體細(xì)胞色素C釋放和Casp