5-羥基多甲氧基黃酮抗結腸癌活性及其分子機制研究.pdf

1、結腸癌是致死率最高的癌癥之一。隨著西方的飲食習慣和生活方式越來越趨于國際化,結腸癌的發(fā)生率也在全球范圍內呈上升趨勢。我們致力于尋找新穎的膳食功能因子來預防和抑制結腸癌的發(fā)生和發(fā)展。多甲氧基黃酮是一類結構獨特的黃酮類化合物,主要存在于橘屬類果實的皮中(陳皮)。目前我們在陳皮中分離得到了一類新穎的多甲氧基黃酮類化合物,也就是5-羥基多甲氧基黃酮。其新穎的結構特點賦予其更加強大的抗腫瘤活性。越來越多的研究表明,特定的具有預防或抑制腫瘤生長的藥

2、物之間在低劑量下聯(lián)合使用可產生協(xié)同效應,這不僅能增強抑制腫瘤的活性而且能降低由于高劑量而引發(fā)的毒副作用。阿托伐他汀是是目前臨床最常用的降膽固醇的藥物,它通過抑制肝臟內HMG-CoA還原酶的活性來降低血漿中膽固醇和脂蛋白水平。最新的報道顯示阿托伐他汀對多種癌細胞具有潛在的抑制活性,尤其是結腸癌細胞。利用先進的細胞培養(yǎng)和動物模型,本課題對三種最主要的5-羥基多甲氧基黃酮抗結腸癌活性及其分子機制進行了系統(tǒng)而深入的研究,并在此基礎上開創(chuàng)性地研究

3、了一個全新的抗癌策略:利用5-羥基多甲氧基黃酮與阿托伐他汀聯(lián)合使用而對結腸癌細胞產生強大的協(xié)同抑制效應。具體實驗結果如下:
　　 1.5-羥基多甲氧基黃酮對結腸癌細胞的顯著抑制作用在此研究中,我們檢測了三個主要的5-羥基多甲氧基黃酮,5-羥基-6,7,8,3',4'-五甲氧基黃酮(5HPMF),5-羥基-3,6,7,8,3',4'-六甲氧基黃酮(5HHMF),和5-羥基-6,7,8,4'-四甲氧基黃酮(5HTMF)抑制兩種人類結

4、腸癌細胞(HCT116和HT29細胞)增殖的效應,同時,我們也系統(tǒng)的比了三個主要5-羥基多甲氧基黃酮與其母體多甲氧基黃酮(分別是:川陳皮素(PMF)、3,5,6,7,8,3',4'-七甲氧基黃酮(HMF)及橘紅素(TMF))抗結腸癌細胞生長的作用。結果顯示,與母體全甲氧基化的多甲氧基黃酮相比,5-羥基多甲氧基黃酮具有更強的抑制結腸癌細胞生長的作用,這表明5-位的羥基基團在增強5-羥基多甲氧基黃酮抗腫瘤活性方面起到了重要作用。流式細胞儀的

5、分析結果顯示,三個5-羥基多甲氧基黃酮能分別對腫瘤細胞周期和細胞凋亡產生不同的效應,這表明三個5-羥基多甲氧基黃酮分別通過不同的作用機制來抑制結腸癌細胞的生長。例如,5HPMF可引起HT29細胞G2/M細胞周期滯留,而5HHMF誘導顯著的G0/G1細胞周期滯留:相反,5HTMF可增加sub-G0/G1期細胞數(shù)目。為了進一步確認三個5-羥基多甲氧基黃酮抑制結腸癌細胞生長的作用機制,我們對細胞總蛋白進行了蛋白質印跡分析,結果表明5-羥基多甲

6、氧基黃酮對結腸癌細胞的抑制作用主要基于它們強效調控細胞增殖和細胞凋亡相關重要蛋白的能力(例如,p21Cip1/Waf1,CDK-2,CDK-4,phosphor-Rb,Mcl-1,caspases3&8,和PARP等蛋白)
　　 2.5-羥基多甲氧基黃酮以p53,Bax和p21依賴方式抑制結腸癌細胞生長利用人類結腸癌HVT116細胞的多種等基因變種細胞(例如:p53+/+,p53-/-,Bax+/-,Bax-/-,p21-/-細

7、胞),我們進一步研究了重要腫瘤調控蛋白p53,Bax和p21在三個主要5-羥基多甲氧基黃酮誘導的腫瘤細胞周期滯留和細胞凋亡中的作用與影響。Annexin V/PI雙染實驗結果表明,5HHMF和5HTMF能顯著地誘導HCT116(p53+/+)細胞的細胞凋亡,而相同濃度的5HHMF和5HTMF處理相同的時間對HCT116(p53-/-)細胞卻無影響。另一方面,5HHMF和5HTMF能顯著地誘導HCT116(Bax+/-)細胞產生細胞凋亡,

8、而對HCT116.(Bax-/-)細胞卻作用甚微。三個5-羥基多甲氧基黃酮都能增加HCT116(p53+/+)細胞G0/G1期細胞數(shù)目,而對HCT116(p53-/-)和HCT116(p21-/-)細胞卻毫無作用。免疫印跡分析結果表明,5HHMF和5HTMF能顯著地增加HCT116(p53+/+)和HCT116(Bax+/-)中活化的caspase-3和活化的PARP的含量,而在HCT116(p53-/-)和HCT116(Bax-/-)

9、細胞中,5HHMF和5HTMF卻只能微弱的增加這兩種活化的蛋白的含量。綜上所述,我們的結果表明,5-羥基多甲氧基黃酮,特別是5HHMF和5HTMF以p53、Bax和p21依賴性方式來誘導結腸癌細胞凋亡及細胞周期滯留。
　　 3.5-羥基-3,6,7,8,3',4'-六甲氧基黃酮(5HHMF)對結腸癌細胞的抑制作用
　　 5HHMF具有顯著的抑制結腸癌細胞生長的作用,它能誘導細胞周期滯留和細胞凋亡,并能廣泛地調節(jié)重要的信號

10、轉導途徑。我們在上述研究的基礎進一步深入地剖析了5HHMF抑制人類結腸癌細胞生長的分子作用機制。結果表明,5HHMF能以劑量依賴方式抑制HT29、HCT16及SW620等多種人類結腸癌細胞的集落形成能力,而且,與以往已報道的結果不同的是5HHMF抑制細胞生長的作用不是通過產生活性氧化物質(ROS)實現(xiàn)的。5HHMF能選擇性地改變與細胞膜相關的重要蛋白,例如K-Ras,EGFR及它們的下游效應物Akt和NFkB的活性。5HHMF也能有效的

11、地抑制Wnt信號轉導通路:它能以劑量依賴方式降低細胞核內β-Catenin的含量,增加細胞漿內E-cadherin的含量。血管生成對腫瘤的發(fā)展有著重要的意義,5HHMF還能以劑量依賴方式有效地抑制血管生成。以上結果表明,5HHMF能從細胞膜、細胞漿、細胞核及血管生成方面來全方位地抑制結腸癌細胞的生長。
　　 4.5-羥基川陳皮素(5HPMF)和5-羥基橘紅素(5HTMF)體內抗結腸癌活性及其藥代動力學研究
　　 上述研究

12、表明5HPMF和5HTMF具有很強的抑制人類結腸癌細胞生長及誘導腫瘤細胞凋亡的作用。我們利用氧化偶氮甲烷(AOM)-誘導的結腸癌大鼠模型進一步研究了5HPMF和5HTMF的體內抗結腸癌活性。用AOM(15 mg/kg)注射F344大鼠兩次,每周一次,然后喂食脂肪含量為20％并混有5HPMF和5HTMF(0.05％和0.1％)的高脂食物8周后處死病取大腸。ACF(結腸癌早期指標)的形成作為實驗的結束點。結腸的ACF用亞甲基藍染色后在顯微鏡

13、下進行分析。結果表明5HPMF能以劑量依賴方式降低每只大鼠總的ACF的數(shù)目及Ac的數(shù)目。而且5HPMF的作用明顯強于5HTMF的作用,例如,5HPMF在降低總的ACF和high-grade dysplasia的作用都顯著強于5HTMF。但是這些體內抗腫瘤結果與體外抗腫瘤研究的結果正好相反:體外研究表明5HTMF在三個5-羥基多甲氧基黃酮中具有最強的抑制腫瘤細胞生長及殺死細胞的作用。為了進一步探索體內外實驗結果差異的原因,我們對5HPMF

14、和5HTMF進行了入血成分、排泄及臟器分布研究。結果表明,5HPMF和5HTMF的濃度都在60min左右時在血清內達到峰值,并且5HPMF在血清中的濃度是5HTMF的10倍左右;5HPMF在尿液中總的排泄量和排泄率都高于5HTMF。結合我們的以前研究我們推測5HTMF具有很弱的水溶性,其脂溶性也比5HPMF低,這使其不易透過生物膜被吸收進入血液,因而其在血液中的濃度相對很低,不能起到抑制ACF形成的作用。
　　 5.5HPMF和

15、阿托伐他汀聯(lián)合使用對結腸癌細胞的協(xié)同性抑制效應
　　 5HPMF在橘皮中具有較高的含量并且它還具有較強的抑制人類結腸癌細胞生長的活性,阿托伐他汀是HMG-CoA還原酶抑制劑,它也是一種潛在的抗癌藥物。在此項研究中我們開創(chuàng)性地研究了一個全新的抗癌策略:低劑量阿托伐他汀和5HPMF聯(lián)合用藥。阿托伐他汀或5HPMF單獨使用時可產生很強的抑制結腸癌細胞生長的效應,但是兩者聯(lián)用后可產生更加強大的抑制效應。根據等效線圖解法分析得知,低劑量阿

16、托伐他汀和5HPMF聯(lián)合用藥產生的對結腸癌細胞的強大抑制來源于兩者的顯著協(xié)同效應。流式細胞儀的分析結果表明,阿托伐他汀和5HPMF聯(lián)合用藥24h后,能協(xié)同性地使大量的細胞滯留在G0/G1期;而聯(lián)合用藥48h或更長時間后,可協(xié)同性地誘導顯著而廣泛的細胞凋亡效應。阿托伐他汀和5HPMF聯(lián)合用藥對腫瘤細胞產生的抑制效應要比單獨使用阿托伐他汀或5HPMF產生的效應顯著很多。我們進一步的研究表明,阿托伐他汀/5HPMF聯(lián)合用藥所產生的協(xié)同效應與增

17、加p21Cip1/Waf1和p27Kip1蛋白的含量;降低CDK-2、CDK-4、CDK-6、Cyclin D1、Mcl-1及p-Rb(Ser780)蛋白的含量;及激活caspase級聯(lián)反應緊密相關。阿托伐他汀/5HPMF聯(lián)合用藥也能選擇性地抑制與細胞膜相關的重要蛋白,例如K-Ras,EGFR及它們的下游效應物Akt的活性。阿托伐他汀/5HPMF聯(lián)合用藥可協(xié)同性地降解細胞膜上EGFR,同時它還能誘導腫瘤抑制蛋白p38 MAPK的磷酸化(

18、活化)。當我們利用p38 MAPK siRNA減低p38基因表達后,阿托伐他汀/5HPMF聯(lián)合用藥誘導的EGFR降解得以抑制。這表明阿托伐他汀/5HPMF聯(lián)合用藥可經p38 MAPK的活化而造成細胞膜EGFR的表達量降低。綜上所述,我們的實驗結果顯示阿托伐他汀/5HPMF聯(lián)合用藥可在抑制人類結腸癌細胞生長和殺死腫瘤細胞方面產生很強的協(xié)同效用,這種協(xié)同效應是通過廣泛地誘導細胞凋亡,造成細胞周期滯留,和調控重要信號轉導通路來實現(xiàn)的。我們的研

19、究有力的證明了阿托伐他汀/5HPMF聯(lián)合用藥的光明前景,為下一步的臨床實驗提供了強有力的證據和生物指標。
　　 綜上所述,5-羥基多甲氧黃酮相比于其母體全甲氧基化的多甲氧基黃酮具有更強的抑制人類結腸癌細胞增殖,誘導細胞凋亡的作用。5-羥基川陳皮素與阿托伐他汀聯(lián)合使用可協(xié)同性地抑制人類結腸癌細胞的生長,增加細胞凋亡。還可以通過抑制表皮生長因子受體(EGFR)激活,降低膜蛋白K-RAS的表達進而抑制其下游信號轉導通路實現(xiàn)其抗癌活性。