結(jié)腸癌細胞獲得性5-氟脲嘧啶耐藥的機制研究.pdf

1、本研究將采用高濃度的5-FU來處理人結(jié)腸癌DLDl和DLD1-TRAIL/R細胞，以建立獲得性5-FU耐藥的結(jié)腸癌細胞，并通過分析耐藥細胞的生物學特性，以探討獲得性5-FU耐藥的可能機制。 實驗方法：在臺盼藍染色后用血細胞計數(shù)器計數(shù)存活細胞進行細胞活力測定；通過Western免疫印跡檢測各種蛋白表達水平；流式細胞儀檢測處理后腫瘤細胞的細胞周期的測定；在得到細胞存活率后用CurveExpert軟件計算各種化療藥物的IC50；各處理

2、組間的差異采用配對的t檢驗來評估。 研究結(jié)果與討論：1)、5-FU耐藥細胞株的建立及細胞活力測定：用濃度逐漸增高(10μM-400μM)的5-FU反復處理DLD1和DLD1-TRAIL/R細胞后，最終得到了5-FU耐藥的細胞，細胞再經(jīng)不同濃度的5-FU處理4天后，DLD-1細胞的IC50為2.5μM，而DLD1-5-FU/R的則高達210.6μM(后者為前者的84倍)；與此同時DLD1-TRAIL/R的IC50僅為4.4μM，而

3、DLD1-TF/R的卻高達105.7μM(后者為前者的24倍)，(P＜0.01)。另外耐藥細胞經(jīng)紫杉醇、順鉑、絲裂霉素以及TRAIL蛋白處理后其IC50與親代細胞無明顯差異(P＞0.05)，說明這些耐藥細胞是對5-FU特異性耐藥。2)、各種蛋白及Bcl-2家族在5-FU耐受細胞株中的過表達及S期停滯在5-FU耐受細胞的改變：Western免疫印跡結(jié)果顯示胸苷酸合成酶、Bax、Bak、Bcl-2、Bcl-w、XIAP、survivin和I

4、LP-2等蛋白在四個細胞株中的表達無明顯差別。Mdr蛋白在DLD1-TF/R中的表達比其他細胞略高；而Bik、Bcl-Xs以及Bcl-XL蛋白在耐藥細胞DLD1-5-FU/R和DLD1-TF/R中的表達均比各自的親代細胞明顯增高，其中Bcl-XL是唯一抗凋亡的保護性蛋白，這說明Bcl-XL蛋白可能是在5-FU耐藥中起了重要的作用。用不同濃度的5-FU處理細胞3天后分析其細胞周期的變化，發(fā)現(xiàn)5-FU可以誘導敏感細胞停滯于S期，而對耐藥細胞

5、的細胞周期幾乎沒有影響。接著用200μM濃度的5-FU處理5-FU敏感細胞24小時，磷酸化H2A.X的表達明顯增高，而且隨著處理時間的延長其表達就越高；然而用相同濃度的5-FU處理5-FU耐藥的細胞，未見相同的現(xiàn)象，這說明5-FU的耐藥與DNA的損傷相關(guān)。3)、過表達的Bcl-XL蛋白在5-FU耐藥中的作用：我們通過將pGT60-hBcl-XL質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至DLD1親代細胞得到穩(wěn)定高表達Bcl-XL的細胞克隆(DLD-1/Bcl-XL)。接

6、著數(shù)據(jù)顯示5-FU在DLD1/Bcl-XL細胞中的IG50為4.5μM，是親代DLD1細胞的1.8倍。同樣，流式細胞儀檢測結(jié)果以及Western免疫印跡法對caspase-3的檢測結(jié)果均提示高表達Bcl-XL對5-FU誘導的凋亡具有一定的保護作用，但是結(jié)果同時也顯示DLD1/Bcl-XL細胞在5-FU處理后仍然出現(xiàn)S期停滯和磷酸化H2A.X水平的升高。 研究結(jié)論： 1)、獲得性5-FU耐藥的結(jié)腸癌細胞中存在Bcl-XL的