轉(zhuǎn)鐵蛋白修飾的載阿霉素氧化石墨烯納米?？鼓z質(zhì)瘤實驗研究.pdf

1、腦膠質(zhì)瘤是中樞神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)生率最高的惡性腫瘤，目前國內(nèi)外針對腦膠質(zhì)瘤的治療原則，強調(diào)在手術(shù)切除腫瘤的基礎(chǔ)上，聯(lián)合放療和化療。因血腦屏障（blood brain barrier，BBB）的存在，化療效果欠佳。近年來，隨著材料科學(xué)的發(fā)展，將材料科學(xué)與醫(yī)學(xué)有機結(jié)合的納米醫(yī)學(xué)逐漸成為研究的熱點。納米氧化石墨烯（nanoscaled graphene oxide，nGO）具有良好的生物安全性，并能大量吸附含芳香環(huán)類藥物，有望成為一種高效的藥物載體。

2、文獻(xiàn)報道膠質(zhì)瘤細(xì)胞表面的轉(zhuǎn)鐵蛋白受體(transferrin receptor, TfR)高表達(dá)，與轉(zhuǎn)鐵蛋白(transferrin,Tf)具有很強的親和力。本研究選用Tf作為靶向功能基，以聚乙二醇(polyethylene glycol, PEG)化的nGO作為藥物載體，通過物理吸附作用，使不能透過BBB的小分子化療藥阿霉素（doxorubicine，Dox）物理吸附到氧化石墨烯(graphene oxide,GO)納米粒的表面，構(gòu)建

3、了一種新型的具有膠質(zhì)瘤靶向性的納米載藥系統(tǒng)，并通過體外、體內(nèi)試驗全面地考察其治療腦膠質(zhì)瘤的效果。
　　第一部分 Tf-PEG-nGO-Dox的合成及檢測
　　目的：選用Tf作為靶向功能基，以富含芳香環(huán)結(jié)構(gòu)的化療藥物Dox為目標(biāo)藥物，以PEG化的nGO作為Dox的藥物載體，使Tf與nGO共價結(jié)合，再使Dox物理吸附到Tf-PEG-nGO的表面，構(gòu)建一種新型的具有膠質(zhì)瘤靶向性的納米載藥系統(tǒng)。
　　方法：將氧化石墨進(jìn)行機械剝

4、離及純化得到氧化石墨烯（GO），將GO反復(fù)超聲振蕩及14,000Da透析袋反復(fù)透析篩選得到nGO，將得到的nGO與六臂聚乙二醇共價合成得到PEG化的nGO（PEG-nGO），將Tf與PEG-nGO共價結(jié)合后，行透析除去未結(jié)合的Tf，得到Tf-PEG-nGO；將Dox加入到Tf-PEG-nGO的水溶液中，非共價吸附反應(yīng)12小時后，反復(fù)透析，去除游離的Dox，得到Tf-PEG-nGO-Dox。以原子力顯微鏡(atomic force mic

5、roscope, AFM)檢測納米載體的粒徑大小及厚度；對Tf-PEG-nGO-Dox進(jìn)行紅外光譜、拉曼光譜、紫外光譜檢測，紫外分光光度計檢測Tf-PEG-nGO-Dox的載藥量；測定其在不同pH值下Dox的釋放速度。
　　結(jié)果：紫外光譜分析顯示nGO最大吸收峰出現(xiàn)在232nm，Tf修飾后，紫外可見光譜出現(xiàn)明顯的改變，232nm處的最大吸收峰消失，而在270nm處出現(xiàn)最大的紫外吸收，對應(yīng)Tf的紫外吸收峰；通過紫外分光光度法對Dox

6、吸附率進(jìn)行了計算，PEG-nGO-Dox及Tf-PEG-nGO-Dox的Dox濃度分別為240μg/mL及277μg/mL，由此計算出PEG-nGO-Dox及Tf-PEG-nGO-Dox對Dox的吸附率分別為127%及115.4%。采用超聲振蕩和孔徑為220nm的過濾膜對GO進(jìn)行分選，選擇得到直徑<220nm能透過過濾膜的nGO，AFM檢測顯示nGO的厚度約為1nm，Tf-PEG-nGO厚度增加到約5nm，推算nGO及Tf-PEG-nG

7、O層數(shù)為1-2層；紅外光譜結(jié)果表明：產(chǎn)物中含有－COOH、－OH、－CO－等含氧基團。Dox釋放試驗顯示在酸性條件下， Dox釋放明顯加快， Tf-PEG-nGO-Dox24、48、72小時Dox釋放率分別為15%、25%及30%。
　　結(jié)論：本研究成功制備了一種粒徑介于100-400nm、層數(shù)1-2層的Tf-PEG-nGO-Dox納米藥物載體，Tf-PEG-nGO-Dox具有高載藥量并在中性條件下穩(wěn)定存在、酸性條件下加速釋放Do

8、x的特性。
　　第二部分 Tf-PEG-nGO-Dox治療膠質(zhì)瘤的體外研究
　　目的：對成功構(gòu)建的Tf-PEG-nGO-Dox進(jìn)行一系列較為系統(tǒng)的體外評價，以檢測其對膠質(zhì)瘤細(xì)胞的細(xì)胞毒作用及靶向性。體外評價包括溶血毒性、細(xì)胞毒性、競爭抑制試驗、胞內(nèi)攝取定量試驗。
　　方法：1、以蒸餾水和生理鹽水分別作為陽性、陰性對照，將不同濃度的納米載體及吸附Dox的納米藥物溶液分別與含2%紅細(xì)胞懸液37℃下反應(yīng)2小時，離心后以紫外分

9、光光度計檢測上清液在550nm處的吸光度，并計算溶血率。2、以MTT法檢測濃度介于0-800μg/mL之間的PEG-nGO、Tf-PEG-nGO對C6細(xì)胞的毒性反應(yīng)，以檢驗其生物安全性。3、將C6細(xì)胞以1×l04/孔密度種于96孔培養(yǎng)板，檢測Dox、PEG-nGO-Dox及Tf-PEG-nGO-Dox在24h時對C6細(xì)胞的抑制作用。4、將C6細(xì)胞以1×l04/孔密度種于96孔培養(yǎng)板，C6細(xì)胞經(jīng)Tf預(yù)孵育后，再檢測Dox、PEG-nGO-

10、Dox及Tf-PEG-nGO-Dox在24h時對C6細(xì)胞的抑制作用。比較三種藥物在經(jīng)Tf預(yù)孵育前后對C6細(xì)胞抑制作用的變化。5、胞內(nèi)攝取定量試驗：比較三種藥物—Dox裸藥溶液、PEG-nGO-Dox溶液、Tf-PEG-nGO-Dox溶液，在相同藥物濃度（Dox濃度3μg/mL）條件，相同的細(xì)胞培養(yǎng)條件，不同時間點（1、2、4、8、12h），采用弱酸性流動相HPLC法進(jìn)行Dox的定量測定，檢測C6細(xì)胞內(nèi)的Dox總含量，以此考察C6細(xì)胞對三

11、種藥物的攝取能力。
　　結(jié)果：1、PEG-nGO、Tf-PEG-nGO、PEG-nGO-Dox、Tf-PEG-nGO-Dox在濃度范圍0.1-5.0μM，37℃下與紅細(xì)胞孵育2小時，紫外分光光度計檢測計算出的溶血率均小于6%。2、MTT法檢測納米載體PEG-nGO及Tf-PEG-nGO對C6膠質(zhì)瘤細(xì)胞的抑制率，發(fā)現(xiàn)隨著載體濃度的增加細(xì)胞毒性增加不明顯，在 PEG-nGO及Tf-PEG-nGO的濃度達(dá)到800μg/mL,活細(xì)胞比例仍

12、大于80%。3、MTT法檢測Dox、PEG-nGO-Dox及Tf-PEG-nGO-Dox對C6細(xì)胞的抑制作用，三種藥物對C6膠質(zhì)瘤細(xì)胞的抑制率隨著藥物濃度的增加而升高。在相同 Dox濃度下，細(xì)胞毒性：PEG-nGO-Dox組

13、含50μg Tf的100mLDMEM培養(yǎng)基孵育30min，再以MTT法檢測Dox、PEG-nGO-Dox及Tf-PEG-nGO-Dox對大鼠C6細(xì)胞的抑制作用，Tf-PEG-nGO-Dox對C6細(xì)胞的抑制作用較未經(jīng) Tf預(yù)處理的 Tf-PEG-nGO-Dox明顯下降，IC50值由13.61上升到40.16μg/mL。5、在相同藥物濃度（Dox濃度3μg/mL）、相同的細(xì)胞培養(yǎng)條件下，于不同時間點（1、2、4、8、12h）分別將三種藥物作

14、用后的C6細(xì)胞以Triton X-100進(jìn)行細(xì)胞裂解，以弱酸流動相HPLC法，測定胞內(nèi)的Dox總含量；以BCA試劑盒測定每份標(biāo)本的蛋白總量，以二者比值作為攝取分?jǐn)?shù)（UI），三種藥物均隨時間延長，進(jìn)入胞內(nèi)的Dox量增加，在藥物作用2小時后，Tf-PEG-nGO-Dox組的胞內(nèi)攝取速度明顯加速，并超過Dox組及PEG-nGO-Dox組。
　　結(jié)論：本試驗構(gòu)建的納米載體及吸附了Dox的載藥體系對紅細(xì)胞的影響很小，沒有明顯的溶血效應(yīng)；PE

15、G-nGO及 Tf-PEG-nGO對 C6細(xì)胞活力無明顯影響。Tf-PEG-nGO-Dox具有一定的膠質(zhì)瘤靶向性，可以在Tf的介導(dǎo)下將更多的Dox轉(zhuǎn)運到膠質(zhì)瘤細(xì)胞內(nèi)，發(fā)揮出更大的抗腫瘤效應(yīng)。
　　第三部分 Tf-PEG-nGO-Dox治療膠質(zhì)瘤的體內(nèi)研究
　　目的：在成功構(gòu)建Tf-PEG-nGO-Dox及體外抗膠質(zhì)瘤試驗的基礎(chǔ)上，建立大鼠C6膠質(zhì)瘤腦內(nèi)移植模型，檢測Dox裸藥、PEG-nGO及Tf-PEG-nGO-Dox在全

16、身主要臟器（心、肝、脾、肺、腎、正常腦組織、腫瘤）的組織分布，觀察其對腫瘤的抑制率及其荷瘤鼠的生存期。
　　方法：1、動物模型制作：雄性SD大鼠以水合氯醛行腹腔注射麻醉后，固定于立體定位儀上。于中線處眼裂后方作1.5cm縱行直切口，暴露前囟，于右側(cè)冠狀縫距中線3 mm處以電鉆鉆直徑約1.0 mm骨孔，暴露硬腦膜。C6細(xì)胞懸液置入微量注射器內(nèi)，垂直進(jìn)針5 mm(距硬膜)，注射10μl含106C6的細(xì)胞懸液。2、組織分布實驗：建模成功

17、后第10天，將9只實驗動物分為3組，分別通過尾靜脈注射Dox、PEG-nGO-Dox及Tf-PEG-nGO-Dox，在注射后3h，以弱酸流動相HPLC檢測Dox在荷瘤大鼠主要臟器及腫瘤內(nèi)的組織分布情況。3、腫瘤體積的抑制率及生存期檢測：12只雄性大鼠，隨機平均分為4組：對照組、Dox裸藥組、nGO-Dox組和Tf-nGO-Dox組。在顱內(nèi)接種后的第7、9、11天分別通過尾靜脈注射藥物，對照組注射生理鹽水，其余三組注入藥物劑量含Dox1.

18、5mg/kg體重/次。在顱內(nèi)接種后的第15天，處死所有的實驗動物，取出腦組織，測定腫瘤體積。另外將40只顱內(nèi)接種的雄性大鼠，隨機平均分為4組：對照組、Dox裸藥組、nGO-Dox組和Tf-nGO-Dox組。在接種后的第7、9、11天分別通過尾靜脈注射藥物，對照組注射生理鹽水，其余三組每次注入藥物劑量含Dox1.5mg/kg體重/次。記錄所有試驗動物生存期。
　　結(jié)果：給藥后3小時，主要臟器及腫瘤組織內(nèi)的Dox含量如下：Dox裸藥組

19、：脾臟>肝臟>腎臟>心臟>肺臟>腫瘤>腦組織；PEG-nGO-Dox組：脾臟>肝臟>腎臟>腫瘤>腦組織>心臟>肺臟；Tf-PEG-nGO-Dox組：脾臟>肝臟>腫瘤>腎臟>腦組織>心臟>肺臟。Tf-PEG-nGO-Dox組腫瘤內(nèi)的Dox含量較Dox裸藥組及PEG-nGO-Dox組明顯上升；較正常腦組織內(nèi)的Dox也明顯上升。連續(xù)3次給藥后，在接種后第15天，Dox、PEG-nGO-Dox及Tf-PEG-nGO-Dox三組的腫瘤體積抑制率分

20、別為10%，25%及33%；對照組、Dox裸藥組、nGO-Dox組及Tf-nGO-Dox組的中位生存期分別為17、19、21、25天。其中Tf-PEG-nGO-Dox組相對于對照組、Dox裸藥組及PEG-nGO-Dox組的生存期延長率分別達(dá)到了47.1%，23.5%及11.8%。
　　結(jié)論：通過立體定向裝置，將膠質(zhì)瘤C6細(xì)胞植入SD大鼠顱內(nèi)，成功構(gòu)建出膠質(zhì)瘤顱內(nèi)移植瘤模型。對荷瘤大鼠行靜脈給藥，HPLC檢測顯示Tf-PEG-nGO