膽堿-聚乙二醇雙修飾蒿甲醚脂質(zhì)納米粒的制備及其體內(nèi)外藥效與初步靶向性研究.pdf

1、目的：
　　感染瘧原蟲的紅細(xì)胞會(huì)特異性表達(dá)生成新滲透性通道（NPPs），并在紅細(xì)胞膜上過表達(dá)膽堿轉(zhuǎn)運(yùn)載體(ECCs）?；诖?，本課題以膽堿-聚乙二醇衍生物（CD-PEG-SA）為修飾分子，構(gòu)建粒徑＜80 nm的膽堿-聚乙二醇雙修飾蒿甲醚脂質(zhì)納米粒（CD-PEG-ARM-NLC），以期靶向紅細(xì)胞膜上的NPP通道和ECC載體，達(dá)到長循環(huán)和靶向抗瘧的作用。制備并表征CD-PEG-ARM-NLC；考察其對約氏瘧原蟲（PyBY265）、惡性

2、瘧原蟲（Pf3D7）的體內(nèi)外抗瘧活性；并通過包載熒光探針香豆素-6研究CD-PEG-NLC對感染紅細(xì)胞的靶向性。
　　方法：
　　1. CD-PEG-ARM-NLC的處方工藝考察
　　在前期工藝研究基礎(chǔ)上，采用高壓乳勻法制備CD-PEG-ARM-NLC，通過對CD-PEG-SA的加入方式、用量進(jìn)行單因素考察，優(yōu)化制備處方。
　　2. CD-PEG-ARM-NLC的質(zhì)量表征
　　對CD-PEG-ARM-NLC

3、的形狀、粒徑、Zeta電位、包封率、載藥量等理化性質(zhì)進(jìn)行表征，考察藥物的體外釋放特性，并進(jìn)行體外溶血試驗(yàn)。
　　3. CD-PEG-ARM-NLC的體外抗瘧活性評價(jià)
　　通過明膠沉降法從常規(guī)培養(yǎng)的Pf3D7中分離得到有/無knob結(jié)構(gòu)的Pf3D7，以ARM為陽性對照，采用常規(guī)培養(yǎng)的、有/無knob結(jié)構(gòu)的Pf3D7，應(yīng)用SYBR Green I法，考察不同濃度的ARM、ARM-NLC、PEG-ARM-NLC、CD-PEG-AR

4、M-NLC對瘧原蟲增殖的抑制作用，以藥物的半數(shù)抑制濃度（IC50）為指標(biāo)考察其體外抗瘧活性。
　　4. CD-PEG-C6-NLC靶向性的初步考察
　　以香豆素-6（C6）為熒光探針，C6溶液為陽性對照，高壓乳勻法制備C6-NLC、PEG-C6-NLC、CD-PEG-C6-NLC。將熒光納米粒分別與體外培養(yǎng)的Pf3D7感染的紅細(xì)胞、在體PyBY265感染的瘧鼠紅細(xì)胞孵育，熒光顯微鏡下觀察熒光分布和強(qiáng)度。通過NPP通道和ECC

5、載體抑制試驗(yàn)，比較不同納米粒組的熒光亮度，分析NPP通道和ECC載體對納米粒進(jìn)入感染紅細(xì)胞的影響。
　　5. CD-PEG-ARM-NLC的體內(nèi)藥效學(xué)研究
　　采用約氏瘧原蟲BY265感染小鼠模型，以溶劑組、三種空白納米粒組，不治療（空白）組為陰性對照，以ARM組為陽性對照，通過四天抑制試驗(yàn)和28天治愈試驗(yàn)考察ARM-NLC、PEG-ARM-NLC、CD-PEG-ARM-NLC三種納米粒的抗瘧活性。
　　結(jié)果：

6、　　1. CD-PEG-ARM-NLC考察后處方
　　CD-PEG-SA的加入方式為外加乙醇法，加入量為m膽堿/m混脂=19.24％（g/g）?？疾旌蟮奶幏浇M成為：GMS1.9286 g，MCT1.0714 g，RH401.2 g，ARM0.768 g， CD-PEG-SA0.5772 g，去離子水100 ml。
　　2. CD-PEG-ARM-NLC的質(zhì)量表征
　　CD-PEG-ARM-NLC是均一、略帶藍(lán)色乳光的半

7、透明液體制劑，透射電鏡結(jié)果顯示納米粒呈類球形，粒徑分布均勻；測定平均粒徑為65.10±0.64 nm，多分散系數(shù)為0.186±0.004；Zeta電位為-24.47±1.01 mV；包封率為87.03%±0.71%；載藥量為11.62%±0.10%；在pH7.4的磷酸鹽緩沖液中72 h內(nèi)體外累積釋放率為81.95%±0.85%，釋藥規(guī)律符合Weibull方程，t50為10.36 h；體外溶血試驗(yàn)無紅細(xì)胞聚集及溶血現(xiàn)象。
　　3.

8、CD-PEG-ARM-NLC的體外抗瘧活性評價(jià)
　　SYBR Green I法測得ARM、ARM-NLC、PEG-ARM-NLC、CD-PEG-ARM-NLC對常規(guī)培養(yǎng)的Pf3D7的IC50值分別為4.28±0.05、3.69±0.07、3.22±0.05、2.68±0.05 nmol/L；對有knob結(jié)構(gòu)的Pf3D7的IC50值分別為4.32±0.06、3.93±0.03、3.58±0.08、3.01±0.05 nmol/L；對

9、無knob結(jié)構(gòu)的Pf3D7的 IC50值分別為4.27±0.06、3.34±0.07、2.81±0.08、2.12±0.09 nmol/L。
　　4. CD-PEG-C6-NLC靶向性的初步考察
　　熒光顯微鏡觀察結(jié)果顯示，納米?；静贿M(jìn)入正常紅細(xì)胞，但可進(jìn)入感染紅細(xì)胞，且能聚集于瘧原蟲周圍，而不是彌散于整個(gè)紅細(xì)胞；CD-PEG-C6-NLC組的熒光強(qiáng)度高于C6-NLC組和PEG-C6-NLC組；以上結(jié)果顯示CD-PEG-C

10、6-NLC對感染紅細(xì)胞有靶向作用。加入NPP抑制劑（呋塞米）可基本阻斷C6-NLC和PEG-C6-NLC進(jìn)入感染紅細(xì)胞，但CD-PEG-C6-NLC仍可進(jìn)入感染紅細(xì)胞；同時(shí)加入NPP抑制劑（呋塞米）和ECC天然底物（膽堿）方能基本阻斷紅細(xì)胞對CD-PEG-C6-NLC的攝取。
　　5. CD-PEG-ARM-NLC的體內(nèi)藥效學(xué)研究
　　陽性對照組ARM尾靜脈注射的ED50值為0.266 mg/(kg·day)，ED90值為0

11、.945 mg/(kg·day)，ARM-NLC、PEG-ARM-NLC、CD-PEG-ARM-NLC的ED50值分別為0.245、0.233、0.228 mg/(kg·day)，ED90值分別為0.927、0.905、0.872 mg/(kg·day)，表明ARM制成納米粒后抗瘧活性有一定的提高。
　　結(jié)論：
　　采用優(yōu)化后處方制備CD-PEG-ARM-NLC，其粒徑、Zeta電位、包封率、載藥量、體外釋放特性和溶血試驗(yàn)等