麥胚凝集素修飾納米跨粘膜細(xì)胞轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)理及入腦通路的初步探討.pdf

1、隨著社會(huì)的發(fā)展及老齡化程度的增加,許多腦內(nèi)疾病已成為威脅人類健康的一大問題。許多蛋白多肽類藥物具有良好的中樞治療活性,但由于藥物在體內(nèi)穩(wěn)定性差以及血腦屏障(BBB)的存在,很大程度上限制了這些藥物的腦部遞送,因而很難發(fā)揮其中樞治療作用。BBB是存在于血液和腦組織間的一層屏障系統(tǒng),由極化的腦毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞通過復(fù)雜的細(xì)胞間緊密連接構(gòu)成,它對(duì)于維系腦內(nèi)環(huán)境的相對(duì)恒定十分重要,但同時(shí)BBB也限制了治療性藥物向腦部的轉(zhuǎn)運(yùn),是藥物進(jìn)入腦組織發(fā)揮治

2、療作用的主要屏障。構(gòu)建新型的具有提高藥物腦內(nèi)遞送能力的藥物傳遞系統(tǒng),已成為藥劑學(xué)的研究熱點(diǎn)。鼻腔嗅粘膜與腦之間存在直接通路,通過鼻腔給藥,有望幫助藥物繞過BBB,提高其腦內(nèi)遞釋,具有很高的研究價(jià)值和臨床意義。
　　 納米粒(NP)遞藥系統(tǒng)是將藥物包載在生物可降解的高分子材料中,可以有效防止藥物在體內(nèi)的降解,提高藥物穩(wěn)定性,有望增加藥物的吸收。然而,普通NP通過鼻腔給藥仍存在許多不足:NP粒徑較大,很難穿過細(xì)胞間緊密連接吸收,透粘

3、膜吸收能力較弱;對(duì)鼻粘膜的粘附能力弱,容易在鼻纖毛擺動(dòng)的影響下被清除,鼻腔中滯留時(shí)間不長,影響了NP的攝取量;在鼻粘膜上缺乏部位選擇性,無法更有效地將藥物轉(zhuǎn)運(yùn)到與腦有通路的嗅粘膜,因而腦內(nèi)遞藥效率差。本課題組高小玲博士構(gòu)建了一種新型的經(jīng)鼻給藥腦內(nèi)遞藥系統(tǒng)-凝集素修飾納米粒遞藥系統(tǒng)。以表面修飾麥胚凝集素的NP(WGA-NP)作為藥物的載體,在增強(qiáng)藥物體內(nèi)穩(wěn)定性的同時(shí),還能與鼻腔嗅粘膜上選擇性高表達(dá)的N-乙酰氨基葡萄糖特異結(jié)合,延長遞藥系統(tǒng)

4、在鼻粘膜上的滯留時(shí)間,介導(dǎo)鼻粘膜特別是嗅粘膜對(duì)遞藥系統(tǒng)的吸收,選擇性地遞送更多的藥物入腦。本課題擬采用體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)及組織切片觀察進(jìn)一步探討WGA-NP遞藥系統(tǒng)跨粘膜的機(jī)理及經(jīng)鼻入腦的通路。
　　 本文第一部分為WGA-NP的構(gòu)建與表征。使用香豆素-6(Cou-6)及量子點(diǎn)(QDs)兩種不同的熒光染料作為探針,將一定比例的甲氧基聚乙二醇-聚乳酸(MPEG-PLA)和馬來酰亞胺聚乙二醇一聚乳酸(MAL-PEG-PLA)經(jīng)乳化/溶媒蒸

5、發(fā)法制備得到NP,該NP表面的馬來酰亞胺基與巰基化的WGA通過共價(jià)連接,得到WGA-NP。制備條件:MPEG-PLA:MAL-PEG-PLA質(zhì)量比為9:1;巰基化試劑2-IT:WGA摩爾比為60:1;MAL-PEG-PLA:WGA摩爾比為3:1;反應(yīng)時(shí)間為9h。
　　 制備得到NP及WGA-NP大小均勻、形態(tài)圓整,平均粒徑100nm左右,Zeta電位-20mV左右。通過免疫電鏡觀察證實(shí)WGA-NP表面連接有WGA;通過紅細(xì)胞凝集

6、試驗(yàn)證實(shí),連接于WGA-NP表面的WGA仍具特異性糖基結(jié)合的活性。通過冷凍電鏡觀察證實(shí)每個(gè)NP內(nèi)部均包封有數(shù)個(gè)熒光探針分子。體外泄漏試驗(yàn)證實(shí)Cou-6體外泄漏量小;通過比較QDs和NP-Ods的光穩(wěn)定性,證實(shí)NP的包封可有效提高QDs的光穩(wěn)定性;通過比較WGA-NP-Cou-6和WGA-NP-QDs的光穩(wěn)定性,證實(shí)QDs熒光壽命更長,光穩(wěn)定性更好,可作為一種新型熒光探針用于遞藥系統(tǒng)的示蹤。
　　 為了考察鼻腔給藥是否優(yōu)于其他常規(guī)

7、給藥方式,第二部分首先比較了中樞活性藥物鹽酸美沙酮,三種途徑大鼠給藥后生物利用度的差別,得到鼻腔給藥起效快,生物利用度較高,安全性相對(duì)較好的結(jié)果。為了評(píng)價(jià)WGA-NP經(jīng)鼻給藥后能否有效提高藥物的入腦量,發(fā)揮藥物的治療活性,進(jìn)一步選用具有促進(jìn)記憶和智力作用的蛋白多肽藥物一血管活性肽(VIP)為模型藥物,采用復(fù)乳/溶媒蒸發(fā)法制備的NP-VIP及WGA-NP-VIP,通過Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)比較不同給藥方案組大鼠間的藥效學(xué)差別,研究WGA-

8、NP遞藥系統(tǒng)用于蛋白多肽類藥物腦內(nèi)遞送的可行性。采用AF64A側(cè)腦室注射構(gòu)建大鼠中樞膽堿能神經(jīng)元損毀AD模型,通過Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)評(píng)價(jià)VIP不同制劑對(duì)大鼠空間記憶障礙的改善作用。結(jié)果證實(shí)癡呆模型組大鼠在行為學(xué)上表現(xiàn)出明顯的空間記憶障礙特征,建模成功;皮下注射及鼻腔給予VIP水溶液,對(duì)于改善AF64A側(cè)腦室注射所致大鼠空間記憶障礙無效,結(jié)果與癡呆模型組無顯著性差異;NP-VIP(25μg/kg)鼻腔給藥后,能夠?qū)Υ笫笾袠心憠A能系統(tǒng)發(fā)

9、揮一定的保護(hù)作用,改善大鼠的空間記憶障礙,說明VIP經(jīng)NP包載后提高了穩(wěn)定性和入腦量;WGA-NP-VIP鼻腔給藥,在劑量減半(12.5μg/kg)的情況下仍可產(chǎn)生明顯的空間記憶改善作用,水迷宮實(shí)驗(yàn)結(jié)果與正常對(duì)照組類似,說明WGA-NP是更有效的腦內(nèi)遞藥系統(tǒng),為具有腦內(nèi)治療活性藥物,特別是穩(wěn)定性差、難以通過血腦屏障的蛋白多肽類藥物腦內(nèi)遞送提供了有效手段。
　　 第三部分為WGA-NP遞藥系統(tǒng)體外跨細(xì)胞轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)理的初步探討。通過體外

10、細(xì)胞培養(yǎng)的方法,成功建立Caco-2細(xì)胞單分子層模型,光學(xué)顯微鏡和電鏡觀察證實(shí)經(jīng)過2l天的培養(yǎng)后,細(xì)胞形成了緊密的單分子層結(jié)構(gòu),并分化出極性上皮細(xì)胞特有的微絨毛及細(xì)胞間緊密連接結(jié)構(gòu);跨膜電阻大于400Ω·cm2,轉(zhuǎn)運(yùn)標(biāo)準(zhǔn)物14C-蔗糖的通透量小于0.5％/h,均符合轉(zhuǎn)運(yùn)實(shí)驗(yàn)的要求?；罴?xì)胞攝取試驗(yàn)及胞內(nèi)定位試驗(yàn)證實(shí)WGA-NP通過粘附在細(xì)胞表面,逐漸被攝取到細(xì)胞內(nèi)部,在胞內(nèi)的分布呈現(xiàn)一定部位特異性,在高爾基體及溶酶體中均觀察到WGA-NP

11、-QDs的熒光點(diǎn)。通過高內(nèi)涵分析儀定量檢測Caco-2細(xì)胞對(duì)WGA-NP-QDs的攝取,觀察到Caco-2細(xì)胞對(duì)WGA-NP-QDs的攝取量比NP-QDs明顯提高;而預(yù)先讓細(xì)胞與各種抑制劑共孵育后,細(xì)胞對(duì)WGA-NP-QDs的攝取均有所下降,與未加抑制劑的對(duì)照組有顯著性差異,說明WGA-NP是通過與Caco-2細(xì)胞表面N-乙酰氨基葡萄糖特異性結(jié)合介導(dǎo)內(nèi)吞,內(nèi)吞包括包被凹陷、穴樣凹陷兩條途徑,高爾基體、溶酶體、微管及肌動(dòng)蛋白均參與細(xì)胞攝取

12、過程。通過HPLC檢測Caco-2細(xì)胞單分子層對(duì)WGA-NP-Cou-6的轉(zhuǎn)運(yùn),觀察到WGA-NP-Cou-6比未修飾的NP-Cou-6透細(xì)胞轉(zhuǎn)運(yùn)量有顯著性增加,轉(zhuǎn)運(yùn)量與溶液濃度呈一定正相關(guān),且存在飽和現(xiàn)象,說明WGA-NP細(xì)胞轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)理為Caco-2細(xì)胞表面特異受體或載體介導(dǎo);細(xì)胞在37℃環(huán)境下對(duì)WGA-NP-Cou-6的轉(zhuǎn)運(yùn)量比4℃有顯著性提高,說明遞藥系統(tǒng)被內(nèi)化,內(nèi)吞需要消耗能量;預(yù)先將各種抑制劑與細(xì)胞共孵育后,細(xì)胞對(duì)WGA-NP-

13、Cou-6的轉(zhuǎn)運(yùn)均有所下降,說明高爾基體、溶酶體、細(xì)胞內(nèi)微管及肌動(dòng)蛋白在藥物轉(zhuǎn)運(yùn)過程中均發(fā)揮了很大作用。由此認(rèn)為WGA-NP跨細(xì)胞轉(zhuǎn)運(yùn)的機(jī)理可能是:WGA-NP與N-乙酰氨基葡萄糖特異結(jié)合,介導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生包被凹陷及穴樣凹陷,在高爾基體、溶酶體、細(xì)胞內(nèi)微管及肌動(dòng)蛋白等細(xì)胞結(jié)構(gòu)參與下轉(zhuǎn)運(yùn)跨過細(xì)胞,整個(gè)轉(zhuǎn)運(yùn)存在濃度飽和,且為能量依賴過程。
　　 第四部分進(jìn)一步探討了WGA-NP遞藥系統(tǒng)經(jīng)鼻給藥后入腦的可能通路。通過熒光顯微鏡觀察NP-C

14、ou-6和WGA-NP-Cou-6鼻腔給藥后不同時(shí)間在鼻粘膜各區(qū)域的分布情況,結(jié)果顯示,給藥5min后在鼻腔各區(qū)的粘膜下已能觀察到WGA-NP的熒光點(diǎn),說明WGA-NP能夠迅速透過粘膜細(xì)胞被吸收;NP與WGA-NP在粘膜豐富的區(qū)域分布較多,且WGA-NP在粘膜下的分布大于NP,說明NP與WGA-NP均易粘附在鼻粘膜表面,增加遞藥系統(tǒng)在鼻腔的滯留時(shí)間,從而提高藥物吸收量,WGA-NP更易被細(xì)胞攝取,具有更強(qiáng)的透粘膜能力;在靠近嗅球的篩板處

15、觀察到WGA-NP的分布量高于NP,提示W(wǎng)GA-NP更易被攝取進(jìn)入嗅球。WGA可與N-乙酰氨基葡萄糖特異結(jié)合,由于鼻腔嗅粘膜上此糖基數(shù)量遠(yuǎn)大于呼吸粘膜,所以觀察到WGA-NP對(duì)嗅粘膜具有選擇性,而未修飾的NP對(duì)嗅粘膜和呼吸粘膜沒有選擇性。通過免疫熒光法標(biāo)記細(xì)胞間緊密連接特有的Z0-1蛋白和鼻粘膜下神經(jīng)束發(fā)現(xiàn),絕大多數(shù)NP及WGA-NP熒光點(diǎn)與Z0-1蛋白不重合,說明NP、WGA-NP很少通過細(xì)胞間途徑轉(zhuǎn)運(yùn),可能主要通過跨細(xì)胞途徑吸收;N