復(fù)制缺陷型腺病毒Ad-pShuttle-CMV-p14ARF聯(lián)合半夏凝集素對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞生長(zhǎng)抑制的研究.pdf

1、隨著社會(huì)的發(fā)展和科學(xué)的進(jìn)步，諸多疾病已經(jīng)能夠治愈。惡性腫瘤已經(jīng)成為人類致死的頭號(hào)殺手，腫瘤治療被認(rèn)為是當(dāng)前醫(yī)學(xué)和生物學(xué)研究的難題之一。腫瘤患者的發(fā)病率和死亡率逐年增加，腫瘤治療傳統(tǒng)方法的發(fā)展已經(jīng)舉步維艱。尋找更加有效安全的治療理念和方法成為當(dāng)前醫(yī)學(xué)和生物學(xué)相關(guān)專業(yè)領(lǐng)域的首要任務(wù)。本研究通過同源重組方式構(gòu)建攜帶p14ARF基因的重組腺病毒Ad-pShuttle-CMV-p14ARF(PCA)。
　　 植物凝集素是一類能特異性凝集細(xì)

2、胞的非酶糖蛋白，由于其能特異性結(jié)合單糖或者糖復(fù)合物，植物凝集素在免疫反應(yīng)、植物防御、信號(hào)傳導(dǎo)及誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡中具有重要作用。甘露糖結(jié)合凝集素是目前研究最深入的凝集素。雪花蓮凝集素是第一個(gè)被研究的凝集素，現(xiàn)在單子葉甘露糖結(jié)合凝集素已經(jīng)被歸類為雪花蓮相關(guān)凝集素，它們廣泛存在于高等植株上，能識(shí)別聚糖復(fù)合物。三葉半夏屬于天南星科半夏，是一種傳統(tǒng)的中草藥，具有兩千多年的藥用歷史。半夏凝集素(Pinelliatemataagglutinin，PTA)

3、屬于單子葉甘露糖結(jié)合植物凝集素，主要儲(chǔ)存于半夏塊莖中，是半夏蛋白的主要藥用活性成分。PTA能特異性識(shí)別并結(jié)合甘露聚糖，而不與單體甘露糖.葡萄糖和麥芽糖結(jié)合。PTA特異性的凝集小鼠血細(xì)胞而不凝集人血細(xì)胞。大量的研究已經(jīng)表明半夏凝集素對(duì)腫瘤細(xì)胞，真菌及病毒等具有良好抑制增生作用，本研究通過同源重組方式構(gòu)建攜帶p14ARF基因的重組腺病毒Ad-pShuttle-CMV-p14ARF(PCA)，并分別研究PCA、PTA單獨(dú)及聯(lián)合使用對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞

4、株SW480及HT-29細(xì)胞增殖的抑制作用。
　　 方法:本研究利用Adeasy系統(tǒng)成功構(gòu)建攜帶p14ARF基因的復(fù)制缺陷型腺病毒，命名為Ad-pShuttle-CMV-p14ARF(PCA);PCR方法鑒定陽(yáng)性重組子病毒;通過在293A細(xì)胞中擴(kuò)增，利用氯化銫(CsCI)密度梯度離心、純化得到高滴度的病毒:運(yùn)用TCID50法在293A中測(cè)出目的病毒PCA的滴度。利用親和層析法分離純化半夏凝集素并測(cè)定濃度。通過MTT法分別檢測(cè)PC

5、A、PTA單獨(dú)及聯(lián)合使用對(duì)細(xì)胞增殖的影響:采用結(jié)晶紫染色法分別定性分析PCA、PTA單獨(dú)及聯(lián)合使用對(duì)兩種結(jié)腸癌細(xì)胞的殺傷作用;Hoechst33258熒光染色法檢測(cè)經(jīng)PCA、PTA單獨(dú)及聯(lián)合使用后，細(xì)胞發(fā)生凋亡的形態(tài)學(xué)變化。
　　 結(jié)果:MTT法檢測(cè)結(jié)果顯示PCA、PTA及聯(lián)合使用均能抑制結(jié)腸癌細(xì)胞SW480及HT-29增殖，隨著藥物劑量增大、作用時(shí)間延長(zhǎng)，細(xì)胞存活率下降，且聯(lián)合使用效果顯著高于二者分別單獨(dú)使用:結(jié)晶紫染色法觀察

6、到不同濃度的PCA、PTA單獨(dú)及聯(lián)合使用對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞SW480和HT-29殺傷作用，殺傷效果隨藥物濃度升高而愈發(fā)明顯。Hoechst33258熒光染色可觀察到PCA組、PTA組及聯(lián)合使用組均出現(xiàn)典型的凋亡小體，聯(lián)合組比單藥組細(xì)胞凋亡更明顯。
　　 結(jié)論:本研究首次將腺病毒與天然半夏凝集素進(jìn)行聯(lián)合使用，探究二者是否具有協(xié)同作用。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明:復(fù)制缺陷型重組腺病毒PCA與半夏凝集素PTA均能抑制結(jié)腸癌細(xì)胞株增殖，聯(lián)合使用效果大于二者