野生型KRAS2基因?qū)Y(jié)腸癌細(xì)胞的抑制效應(yīng)及其在結(jié)腸癌中雜合性缺失的研究.pdf

1、本文研究了結(jié)腸癌組織KRAS2基因所在區(qū)域染色體12p12-13雜合性缺失，以了解該區(qū)域因染色體不穩(wěn)定而發(fā)生的DNA片段丟失情況，探索野生型KRAS2基因在結(jié)腸癌發(fā)生發(fā)展過(guò)程中可能發(fā)生的遺傳學(xué)改變。進(jìn)一步觀(guān)察野生型KRAS2基因?qū)θ私Y(jié)腸癌細(xì)胞株Caco-2的生長(zhǎng)影響作用，以深入探討這一原癌基因的抑癌作用和機(jī)制。 方法 1)從10例結(jié)腸癌手術(shù)切除標(biāo)本中，提取腫瘤、癌旁及相應(yīng)正常組織的DNA，用熒光標(biāo)記多重微衛(wèi)星PCR-變性

2、聚丙烯酰胺凝膠電泳技術(shù)，對(duì)染色體12p12-13雜合性缺失進(jìn)行分析。 2)野生型KRAS2基因的克隆及含KRAS2基因真核表達(dá)載體pCI-neo的構(gòu)建。 3)將野生型KRAS2基因轉(zhuǎn)染結(jié)腸癌細(xì)胞株Caco-2并篩選穩(wěn)定表達(dá)的克隆。 4)采用四甲基偶氮唑(MTT)法觀(guān)察細(xì)胞的生長(zhǎng)情況，用流式細(xì)胞儀觀(guān)察細(xì)胞周期的情況，用WesternBlot檢測(cè)Caco-2細(xì)胞表達(dá)野生型KRAS2蛋白情況。 結(jié)果 1

3、)10例癌旁組織中有3例(30％)在12p12-13處至少有一個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)出現(xiàn)雜合性缺失，其中D12S1034出現(xiàn)頻率最高，為28.57％(2/7)；10例原發(fā)性結(jié)腸癌標(biāo)本中6例(60％)在12p12-13處至少有一個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)出現(xiàn)雜合性缺失，D12S1034、D12S1591是高頻率缺失集中的區(qū)域，均占42.88％(3/7)；癌旁組織、癌組織均發(fā)生雜合性缺失的標(biāo)本有3例，占30％(3/10)；僅在癌組織中發(fā)生雜合性缺失的標(biāo)本有3例，占

4、30％(3/10)；僅在癌旁組織中發(fā)生雜合性缺失，癌組織無(wú)信號(hào)的標(biāo)本1例。 2)雜合性缺失的頻率與腫瘤病人的年齡、性別、腫瘤大小、部位及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移均無(wú)關(guān)。 3)KRAS2基因的克隆未及突變。 4)與對(duì)照組細(xì)胞相比，轉(zhuǎn)染野生型KRAS2的Caco-2細(xì)胞生長(zhǎng)相對(duì)緩慢(P＜0.05)；G0～G1期細(xì)胞比例增高(轉(zhuǎn)染組和對(duì)照組分別為50.22％和35.79％)，G2～M期細(xì)胞比例降低(轉(zhuǎn)染組和對(duì)照組分別為16.90％和