根癌農(nóng)桿菌介導凝集素基因轉化柑橘遺傳體系的研究.pdf

1、本試驗采用農(nóng)桿菌介導方法，以模式植物煙草(Nicotiana benthamiana)和蕓香科植物甜橙(Citrus sinensis)、夏橙(Citrus Natsudaidai Hayata)為材料，成功建立了凝集素基因的遺傳轉化技術體系，取得的主要試驗結果如下：
　　 1枳殼凝集素基因克隆及分析，采用TA克隆法獲得了枳殼凝集素基因完整ORF序列，其全長為801bp，編碼一個267個氨基酸的開放閱讀框。將該基因插入原核表達載

2、體pET-28a(+)，獲得重組載體pET-28a(+)-PTA-NH15，轉化大腸桿菌BL21(DE3)，在1 mmol/L IPTG誘導下高效表達，SDS-PAGE分析結果表明，pET-28a(+)-PTA-NH15基因在大腸桿菌中成功地進行了表達，大小為29 kDa。
　　 2枳殼凝集素基因植物表達載體構建根據(jù)植物表達載體pCAMBIA1301S上的多克隆位點設計相應引物，利用帶有相應酶切位點的引物擴增得到編碼完整開放閱讀

3、框的枳殼凝集素基因，電擊轉化農(nóng)桿菌EHA105感受態(tài)細胞，經(jīng)雙酶切驗證，該基因已成功構建到了植物表達載體pCAMBIA1301S上。
　　 3枳殼及外源半夏凝集素基因遺傳轉化技術體系建立通過試驗條件的優(yōu)化，最終分別建立了煙草(Nicotiana benthamiana)和柑橘(Citrus)的凝集素基因遺傳轉化技術體系：試驗結果表明，煙草葉盤在農(nóng)桿菌侵染液中侵染10min，MS(附加100mMol/LAS)共培養(yǎng)基上共培養(yǎng)2d，

4、MS選擇培養(yǎng)基(附加400mg/L頭孢霉素Cef+卡那霉素Kan50mg/L)中進行選擇培養(yǎng)時，抗性芽再生率較高，為92.5%，抗性芽在1/2MS+200mg/Lcef+0.3mg/L NAA生根培養(yǎng)基中成功誘導生根；柑橘莖段在農(nóng)桿菌侵染液中侵染30min，MT共培養(yǎng)基上共培養(yǎng)3d，MT選擇培養(yǎng)基(附加Kan50mg/L)上進行選擇培養(yǎng)時，抗性芽再生率較高為88.2%，且抗性芽在1/2MT(附加活性炭0.05 g/L)培養(yǎng)基上生根率較高