靈芝烯酸B逆轉ABCB1介導的腫瘤多藥耐藥活性評價及作用機制研究.pdf

1、肝癌是最常見的惡性腫瘤之一，在我國肝癌導致的死亡僅次于肺癌，居第二位。雖然臨床上使用的抗腫瘤藥多柔比星(doxorubicin，DOX)、長春新堿(vincristine，VCR)、紫杉醇(paclitaxel)等具有較好的療效，但長期持續(xù)使用這些藥物極易產(chǎn)生腫瘤多藥耐藥(multidrug resistance，MDR)。據(jù)美國臨床腫瘤學會(ASCO)統(tǒng)計，90％以上腫瘤患者死亡原因或多或少與腫瘤MDR有關，其中ATP結合盒(ATP

2、binding casssette，ABC)轉運蛋白過表達是引起MDR的主要原因。目前為止，還沒有耐藥逆轉劑被美國食品藥品監(jiān)督管理局(FDA)批準上市，因此從傳統(tǒng)中藥中尋找高效、低毒的耐藥逆轉劑是當前研究的熱點。
　　靈芝烯酸B(Ganoderenic acid B，GAB)是從傳統(tǒng)中藥靈芝中分離得到的羊毛甾烷型三萜化合物，已經(jīng)發(fā)現(xiàn) GAB對多種腫瘤細胞均具有殺傷作用，但是，其殺傷腫瘤細胞的作用機理還沒有研究清楚。目前為止，尚未見

3、GAB在逆轉腫瘤MDR方面的報道。本研究發(fā)現(xiàn)了GAB可以顯著逆轉ABCB1介導的腫瘤MDR，并揭示了其逆轉MDR的作用機理。
　　目的：評價GAB逆轉腫瘤MDR的活性并揭示其作用機制，為將GAB發(fā)展成為MDR逆轉劑先導化合物提供科學依據(jù)。
　　方法：(1)采用MTT法初步篩選和評價靈芝提取分離單體的耐藥逆轉活性；(2)采用MTT法評價 GAB對 HepG2和MCF-7細胞及對應的耐藥性細胞 HepG2/ADM和MCF-7/A

4、DR的增殖抑制作用，確定其非毒劑量；(3)采用 MTT法對GAB逆轉腫瘤耐藥細胞HepG2/ADM和MCF-7/ADR的活性進行評價，并以敏感細胞株HepG2和MCF-7作為對比；(4)使用熒光酶標儀評價 GAB對羅丹明-123(rhodamine-123，Rhm-123)在HepG2/ADM細胞內(nèi)累積的影響；(5)采用siRNA干擾ABCB1表達確認GAB逆轉作用是否依賴于ABCB1的表達水平；(6)采用Western blot法檢測

5、GAB對ABCB1蛋白表達水平的影響；(7)使用Pgp-GloTM ATPase試劑盒檢測GAB對ABCB1 ATPase活性的影響；(8)采用 MTT法評價 GAB逆轉作用的持續(xù)性；(9)采用 Docking分子對接模型模擬分析 GAB與ABCB1分子的對接方式和結合位點；(10)使用P450-GloTM screening systems試劑盒檢測GAB對CYP3A4酶活性的影響。
　　結果：(1)初步篩選和評價發(fā)現(xiàn)GAB具有

6、較好逆轉腫瘤耐藥的活性；(2) GAB(10μM)對腫瘤細胞HepG2/ADM和MCF-7/ADR及其對應的敏感細胞株HepG2和MCF-7均沒有明顯的抑制作用，因此采用10μM和5μM作為檢測濃度；(3) GAB可顯著增加DOX、VCR和Paclitaxel在耐藥細胞HepG2/ADM上的敏感性，但對于敏感細胞HepG2沒有明顯的影響，此外，GAB并不影響順鉑(Cisplatin)在HepG2/ADM和HepG2細胞上的敏感性；(4)

7、 GAB可促進Rhm-123在耐藥細胞HepG2/ADM中的累積，并且抑制Rhm-123的外排；(5) GAB的逆轉作用依賴于ABCB1的表達水平；(6)但是，GAB既對ABCB1蛋白的表達沒有明顯的影響；(7)也對ABCB1 ATPase活性沒有顯著影響；(8) GAB的逆轉作用不具有持續(xù)性；(9) GAB和VRP與ABCB1分子的結合位置不重疊；(10) GAB不影響CYP3A4酶的活性。
　　結論：GAB可顯著地逆轉ABCB