腫瘤多藥耐藥逆轉(zhuǎn)劑篩選方法的建立及活性分析.pdf

1、多藥耐藥(Multidrug Resistance，MDR)是目前造成腫瘤化療失敗的重要原因，尋找合適的MDR逆轉(zhuǎn)劑已成為腫瘤藥物研究的關(guān)鍵性問題。本研究建立了腫瘤細(xì)胞多藥耐藥逆轉(zhuǎn)劑的篩選體系，然后對多種中草藥和天然產(chǎn)物進(jìn)行了篩選，篩選出了兩種對不同耐藥細(xì)胞系均具有較好逆轉(zhuǎn)性的生物堿，并對逆轉(zhuǎn)機(jī)制做了初步的探索。
　　 首先，本研究建立了篩選腫瘤多藥耐藥逆轉(zhuǎn)劑的體系。本實(shí)驗(yàn)選取了兩種不同的耐藥細(xì)胞系建立了三種不同耐藥蛋白的多藥耐

2、藥逆轉(zhuǎn)劑的篩選體系。P-gp蛋白是研究最早也是研究最為透徹的耐藥蛋白，在本研究中，首先在功能上確定了多藥耐藥細(xì)胞MCF-7/Adr中P-gp蛋白的外排功能，然后通過RT-PCR在細(xì)胞中檢測到了P-gp蛋白RNA水平的表達(dá)，最后通過SRB細(xì)胞毒實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)細(xì)胞毒性藥物doxorubicin的IC50值在MCF-7及其耐藥細(xì)胞系MCF-7/Adr中分別6.86±0.20μ M和40.5±1.65μ M，耐藥倍數(shù)達(dá)到了5.90倍；加入逆轉(zhuǎn)劑Ver

3、apamil處理后，MCF-7/Adr的IC50值為1.7±0.12μ M，逆轉(zhuǎn)倍數(shù)為23.69。IC50值的降低，BCRP是較晚發(fā)現(xiàn)的ABC家族成員，本研究中，功能上確定了MCF-7/Adr細(xì)胞中BCRP蛋白的外排功能，然后通過RT-PCR在細(xì)胞中檢測到了BCRP蛋白RNA水平的表達(dá)，最后發(fā)現(xiàn)對MCF-7及其耐藥細(xì)胞系MCF-7/Adr來說，Mitoxantrone的IC50值分別為37.72±1.85μ M和6.32±0.10μ M

4、，耐藥倍數(shù)為5.96倍；逆轉(zhuǎn)劑FTC處理過后的Mitoxantrone的IC50值為1.63±0.01，逆轉(zhuǎn)倍數(shù)為23.10。MRP1蛋白也是重要的多藥耐藥蛋白。本研究中，功能上確定了a549/DDP細(xì)胞中MRP1蛋白的外排功能，然后通過RT-PCR在細(xì)胞中檢測到了MRP1蛋白RNA水平的表達(dá)，最后發(fā)現(xiàn)a549及其耐藥細(xì)胞系a549/DDP，Doxorubicin的IC50值分別為4.43±0.248μ M和0.31±0.01μ M，耐

5、藥倍數(shù)達(dá)到了14.47倍。MK571處理過的a549/DDP的IC50為0.52±0.03μ M，逆轉(zhuǎn)倍數(shù)為8.57.
　　 其次利用建立好的篩選體系，從多種中草藥提取物和天然產(chǎn)物中，成功篩選出來了兩種具有逆轉(zhuǎn)活性的天然產(chǎn)物胡椒堿(Pip)和海罌粟堿(Gla)。其中，胡椒堿和海罌粟堿均對a549/DDP和MCF-7/Adr的耐藥性有一定的逆轉(zhuǎn)活性，且該活性具有一定的濃度依賴和時間依賴性。對于a549/DDP來說，50μ M胡椒堿

6、(Pip)處理后的IC50為0.28±0.02μ M，逆轉(zhuǎn)倍數(shù)達(dá)到了14.14倍。對50μ M海罌粟堿(Gla)處理后的IC50為0.60±0.06μ M，逆轉(zhuǎn)倍數(shù)也達(dá)到了12.42倍；對于MCF-7/Adr來說，50μ M胡椒堿(Pip)處理后的IC50為1.26±0.20μ M，逆轉(zhuǎn)倍數(shù)達(dá)到了32.15倍。而對50μ M海罌粟堿(Gla)處理后的IC50為0.86±0.23μ M，逆轉(zhuǎn)倍數(shù)也達(dá)到了46.64倍。
　　 最后，