亞低溫對(duì)星形膠質(zhì)細(xì)胞缺氧-復(fù)氧時(shí)Cx43及其磷酸化水平的影響.pdf

1、目的：觀察缺氧/復(fù)氧條件下星形膠質(zhì)細(xì)胞縫隙連接蛋白的變化以及亞低溫對(duì)其變化的影響，探討星形膠質(zhì)細(xì)胞縫隙連接蛋白與腦缺血的關(guān)系以及亞低溫對(duì)腦缺血的保護(hù)機(jī)制。
　　 方法：選取新生24小時(shí)內(nèi)SD大鼠新鮮腦組織皮層，參照McCarthy等的方法加以改進(jìn)進(jìn)行星形膠質(zhì)細(xì)胞原代培養(yǎng)，調(diào)整細(xì)胞密度為1.0x105/Cm2，接種子含胎牛血清培養(yǎng)基的培養(yǎng)瓶中，置于細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)。7-8天后傳代，傳至第3代，細(xì)胞自然純化后，用神經(jīng)膠質(zhì)纖維酸性蛋白免疫

2、熒光鑒定星形膠質(zhì)細(xì)胞(AC)，95％以上為陽(yáng)性細(xì)胞，符合實(shí)驗(yàn)要求。將AC分為正常對(duì)照組(C)、缺氧/復(fù)氧常溫組(H/R)、缺氧/復(fù)氧亞低溫組(H/R+M)。用三氣培養(yǎng)箱以95％N2、5％CO2造成細(xì)胞缺氧，記錄缺氧損傷時(shí)間，缺氧8小時(shí)后分別調(diào)節(jié)溫度37℃及32℃，開始記復(fù)氧時(shí)間。每組設(shè)復(fù)氧0h、2h、4h、8h、12h、24h、48h，7個(gè)時(shí)間點(diǎn)，建立AC缺氧/復(fù)氧模型。應(yīng)用MTT方法測(cè)定細(xì)胞活力。應(yīng)用劃痕標(biāo)記染料示蹤技術(shù)(SLDT)在

3、激光掃描共聚焦顯微鏡(LSCM)下測(cè)定缺氧/復(fù)氧各個(gè)時(shí)間點(diǎn)熒光黃染料(LY)擴(kuò)散距離，以評(píng)定縫隙連接(GJ)功能。Western-blot法半定量分析Cx43、P-Cx43的表達(dá)情況，免疫熒光染色觀察Cx43、P-Cx43表達(dá)情況。采用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件包進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，多組間比較采用單因素方差分析(One-Way ANOVA)，組間兩兩比較用SNK法，兩樣本間比較用t檢驗(yàn)，P＜0.05為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 結(jié)果：

4、　　 1．體外純化培養(yǎng)AC及GFAP鑒定結(jié)果：AC傳至3代后，細(xì)胞胞體較扁而大，具有多而較粗大的突起，細(xì)胞形態(tài)不規(guī)則，輪廓清晰，GFAP免疫熒光染色顯示紅色。
　　 2．MTT法檢測(cè)細(xì)胞活力：亞低溫組與對(duì)照組比較細(xì)胞吸光度下降，與常溫組比較明顯增加，細(xì)胞損傷減輕，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。
　　 3．(1)常溫組：Cx43蛋白的表達(dá)量隨時(shí)間變化沒(méi)有顯著改變。P-Cx43蛋白表達(dá)量在缺氧/復(fù)氧后呈現(xiàn)先增高后降低的

5、趨勢(shì)（P＜0.05），復(fù)氧2h達(dá)最高，與對(duì)照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。缺氧后LY擴(kuò)散距離較對(duì)照組無(wú)明顯變化，復(fù)氧后出現(xiàn)先降低后增加的趨勢(shì)，于復(fù)氧2h降至最低，與對(duì)照組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。(2)亞低溫組：Cx43蛋白的表達(dá)量在缺氧8h后出現(xiàn)下降，復(fù)氧后2h降至最低，隨后又開始逐漸升高（P＜0.05），與常溫組及對(duì)照組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。P-Cx43表達(dá)量的變化與Cx43呈現(xiàn)一致性。缺氧后L

6、Y擴(kuò)散距離即開始下降，在各個(gè)時(shí)間點(diǎn)均較常溫組減少，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。
　　 結(jié)論：
　　 1．缺氧/復(fù)氧可以引起星形膠質(zhì)細(xì)胞損傷，活力下降。亞低溫可以改變損傷后細(xì)胞活力，減輕缺氧/復(fù)氧后星形膠質(zhì)細(xì)胞的損傷。
　　 2. 37℃缺氧/復(fù)氧后GJ功能的下降與P-Cx43水平的變化有關(guān)。3.32℃缺氧/復(fù)氧早期GJ功能的下降可能主要為亞低溫抑制Cx43蛋白的表達(dá)，使蛋白水平下降；后期抑制作用降低，GJ功