亞低溫對星形膠質細胞缺氧-復氧后縫隙連接功能的影響.pdf

1、目的: 觀察缺氧/復氧條件下星形膠質細胞縫隙連接的變化以及亞低溫對其變化的影響，探討星形膠質細胞縫隙連接與腦缺血的關系以及亞低溫對腦缺血的保護機制。
　　 方法: 利用新生24小時SD大鼠腦皮質為原料，采用Manthorp連續(xù)傳代法建立穩(wěn)定的星形膠質細胞的體外純化培養(yǎng)體系，利用倒置顯微鏡觀察細胞生長及分化的形態(tài)學變化。以神經(jīng)膠質纖維酸性蛋白（GFAP）免疫細胞化學染色鑒定星形膠質細胞，95％以上為陽性細胞，符合實驗要求。采用三氣

2、培養(yǎng)箱分別調(diào)節(jié)溫度37℃及32℃，缺氧12h后分別復氧30min、1h、2h、3h、6h成功建立了星形膠質細胞缺氧/復氧模型，分為正常對照組(C)、常溫缺氧/復氧組(H/R)、亞低溫干預缺氧/復氧組(M+H/R)。用臺盼藍染色法測定37℃及32℃時，缺氧/復氧不同時間點AC的存活率，作為細胞受損指標，用倒置相差顯微鏡對細胞進行形態(tài)學觀察。應用劃痕標記染料示蹤技術（SLDT）在激光掃描共聚焦顯微鏡(LSCM)下測定缺氧/復氧各個時間點熒光

3、黃染料（LY）在縫隙連接間的擴散距離，以測定縫隙連接水平。應用細胞免疫熒光技術檢驗缺氧/復氧各個時間點星形膠質細胞縫隙連接的主要成份縫隙連接蛋白Cx43的蛋白表達水平及亞低溫的干預效果,并進行蛋白表達半定量分析。
　　 結果:
　　 1. AC體外純化培養(yǎng)后，細胞胞體較大,具有多而粗大的突起,形態(tài)不規(guī)則,輪廓較清晰。GFAP免疫細胞化學染色鑒定星形膠質細胞胞漿呈棕黃色。
　　 2. 37℃缺氧12小時后，細胞的形

4、態(tài)、存活力變化不明顯，部分細胞邊緣皺縮。復氧開始后，可見AC出現(xiàn)胞體增大,細胞腫脹, 輪廓不清，突觸回縮，細胞損傷表現(xiàn)明顯加強等現(xiàn)象，隨復氧時間的延長，可見細胞碎片和漂浮細胞增多。細胞存活力下降，呈明顯的時效關系。亞低溫干預時大部分細胞狀態(tài)較常溫組好。細胞輪廓較清晰，胞周光暈明顯，突起存在，僅有少數(shù)細胞出現(xiàn)分離現(xiàn)象。細胞存活力較常溫缺氧/復氧組增加。
　　 3.劃痕染料示蹤方法觀察熒光黃染料擴散距離發(fā)現(xiàn)： 37℃缺氧12h，染料

5、仍可在細胞間進行擴散，擴散距離較對照組無明顯變化(P>0.05)，復氧開始后染料擴散距離明顯下降，于復氧2h降至最低，而后隨復氧時間延長擴散距離呈逐漸增加趨勢，與對照組復氧各時間點相比差異有顯著性(P<0.01)。 亞低溫干預缺氧/復氧時熒光染料擴散距離在各個時間點均較37℃缺氧/復氧組減少，差異有顯著性 (P<0.01)。
　　 4. 細胞免疫熒光半定量方法觀察Cx43的表達發(fā)現(xiàn)：37℃缺氧/復氧各時間點蛋白熒光強度較對照組無

6、明顯變化（P>0.05)；亞低溫干預缺氧12h，Cx43熒光強度較對照組減少（P<0.01),而復氧后CX43熒光強度呈現(xiàn)先降低后升高趨勢。在各個時間點與37℃缺氧/復氧組相比差異有顯著性(P<0.01)。
　　 結論:
　　 1. 體外培養(yǎng)的星形膠質細胞對缺氧有耐受性，復氧后細胞損害隨著時間延長逐漸加重。 亞低溫可以減輕缺氧/復氧時星形膠質細胞的損傷。
　　 2. 星形膠質細胞在缺氧/復氧后縫隙連接仍處于開放狀