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文檔簡介
1、目的:探討黃芪甲苷(astragasolide IV,ASIV)對氧糖剝奪復(fù)氧(oxygen glucose deprivation reperfusion,OGD/R)后星形膠質(zhì)細(xì)胞上腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-alpha,TNF-α)與水通道蛋白-4(aquaporin-4,AQP-4)表達(dá)的影響。
方法:選用第二代第一天的星形膠質(zhì)細(xì)胞。將星形膠質(zhì)細(xì)胞以每孔2.5萬的濃度接種到96孔板,分
2、別用0.01、0.1、1、10、100ng·mL-1的TNF-α和0.001、0.01、0.1μmol·mL-1黃芪甲苷進(jìn)行干預(yù)。用CCK-8試劑盒檢測星形膠質(zhì)細(xì)胞活性的變化。將星形膠質(zhì)細(xì)胞分別用0.5、5、10、30、50ng·mL-1的TNF-α進(jìn)行干預(yù),用RT-PCR方法檢測AQP-4基因表達(dá)水平的變化。將星形膠質(zhì)細(xì)胞分為sham組、TNF-α干預(yù)組、0.001μmol·mL-1ASIV+TNF-α干預(yù)組、0.01μmol·mL-
3、1ASIV+TNF-α干預(yù)組、0.1μmol·mL-1ASIV+TNF-α干預(yù)組,用RT-PCR方法檢測AQP-4基因表達(dá)水平的變化。將星形膠質(zhì)細(xì)胞放入缺氧培養(yǎng)箱(1%O2、94%N2、5%CO2),分別干預(yù)1、2、3、4h,復(fù)氧24h后用RT-PCR和Western Blot檢測AQP-4和TNF-α的表達(dá)情況。將星形膠質(zhì)細(xì)胞分為control組、OGD/R組、OGD/R+0.001μmol·mL-1ASIV組、OGD/R+0.01μ
4、mol·mL-1ASIV組,用RT-PCR和免疫熒光檢測AQP-4和TNF-α的表達(dá)情況。
結(jié)果:當(dāng)TNF-α的濃度為0~100ng·mL-1時對星形膠質(zhì)細(xì)胞無毒性作用可以用于后續(xù)實(shí)驗;所選濃度的黃芪甲苷均可提高星形膠質(zhì)細(xì)胞活性,無毒性作用,可以用于后續(xù)實(shí)驗;與control組相比,各個TNF-α干預(yù)組的AQP-4基因表達(dá)水平均升高,并且具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05),但是10ng·mL-1TNF-α干預(yù)組誘導(dǎo)AQP-4基因表
5、達(dá)的作用最為明顯;0.001、0.01、0.1μmol·mL-1黃芪甲苷+TNF-α三個干預(yù)組的AQP-4基因表達(dá)水平與TNF-α干預(yù)組相比明顯降低(P<0.05),但是仍高于sham組;與control組相比,AQP-4基因在缺氧1h和2h時表達(dá)無顯著變化,在缺氧3h時,表達(dá)達(dá)到高峰(P<0.05),在缺氧4h時,表達(dá)有所減弱但是仍高于control組(P<0.05);與control組相比,氧糖剝奪1、2、3、4h組的AQP-4蛋白
6、表達(dá)水平均升高(P<0.05),并且氧糖剝奪后AQP-4蛋白表達(dá)水平的高峰出現(xiàn)在氧糖剝奪3h時(P<0.05);與control組相比,TNF-α基因在缺氧1h時,表達(dá)達(dá)到高峰(P<0.05),在缺氧2h時表達(dá)有所減弱但是仍高于control組(P<0.05)。在缺氧3h和4h時,與control組相比,表達(dá)無明顯變化;與control組相比,氧糖剝奪1、2、3、4h組的TNF-a蛋白表達(dá)水平均升高(P<0.05),并且氧糖剝奪后TNF
7、-a蛋白表達(dá)水平的高峰出現(xiàn)在氧糖剝奪1h時(P<0.05);OGD3h+0.001μmol·mL-1ASIV組和OGD3h+0.01μmol·mL-1ASIV組的AQP-4基因表達(dá)水平較OGD3h組相比明顯降低(P<0.05),但是前者仍高于control組(P<0.05),后者低于control組(P<0.05);與control組相比,缺氧3h組的AQP-4蛋白表達(dá)水平明顯升高(P<0.05),與缺氧3h組相比,缺氧3h+0.001
8、μmol/mlASI組的AQP-4蛋白表達(dá)水平明顯降低(P<0.05);OGD1h+0.001μmol·mL-1ASIV組和OGD1h+0.01μmol·mL-1ASIV組的TNF-α基因表達(dá)水平與OGD1h組相比明顯降低(P<0.05)并且仍高于control組(P<0.05);與control組相比,缺氧1h組的TNF-α蛋白表達(dá)水平明顯升高(P<0.05),與缺氧1h組相比,缺氧1h+0.001μmol/ml ASIV組的TNF-
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