左旋丁基苯酞抑制氧糖剝奪-復(fù)氧后小鼠腦膠質(zhì)細(xì)胞內(nèi)NF-κB的激活及機(jī)制.pdf

1、腦缺血后神經(jīng)功能的最終恢復(fù)不僅有賴于對(duì)神經(jīng)元和灰質(zhì)的保護(hù)，而且也有賴于對(duì)白質(zhì)的保護(hù)。而膠質(zhì)細(xì)胞作為腦白質(zhì)的主要組成細(xì)胞，深入研究其缺血性損傷的機(jī)制及抑制手段就顯得尤為必要和重要。 膠質(zhì)細(xì)胞對(duì)炎癥、外傷等損傷具有反應(yīng)性增生的能力，即膠質(zhì)細(xì)胞數(shù)目增加，細(xì)胞增殖、肥大，較正常時(shí)出現(xiàn)更多的膠質(zhì)絲和突起，代謝活動(dòng)增強(qiáng)。增生的膠質(zhì)細(xì)胞及其突起可以包圍受損、變性的神經(jīng)元，過(guò)度的膠質(zhì)化可阻礙髓鞘和軸突的再生，影響周圍神經(jīng)組織的結(jié)構(gòu)修復(fù)和功能恢復(fù)

2、。增生膠質(zhì)細(xì)胞形成的膠質(zhì)瘢痕甚至還可能成為腦缺血后繼發(fā)性癲癇病灶。目前對(duì)腦缺血/再灌注損傷機(jī)制的研究，主要集中在細(xì)胞內(nèi)鈣超載、興奮性毒性氨基酸、氧自由基損傷、炎癥反應(yīng)、細(xì)胞凋亡調(diào)控基因、胱冬酶家族基因、即早反應(yīng)基因等方面。其中，缺血/再灌注后炎癥反應(yīng)促進(jìn)了繼發(fā)性腦損害，是腦缺血/再灌注損傷的主要原因之一。而膠質(zhì)細(xì)胞的反應(yīng)性增生也與炎癥反應(yīng)中分泌的細(xì)胞因子IL-1β、TGF、NGF等有關(guān)。因此，關(guān)注膠質(zhì)細(xì)胞在腦缺血后的炎癥反應(yīng)及與之相關(guān)的

3、抗炎、神經(jīng)保護(hù)途徑將對(duì)缺血性腦卒中的治療和后期康復(fù)具有重要而現(xiàn)實(shí)的意義。 核因子-κB(nuclear factor-kappa B，NF-κB)是一種重要的細(xì)胞核內(nèi)轉(zhuǎn)錄因子，其主導(dǎo)調(diào)節(jié)一系列與炎癥相關(guān)的細(xì)胞因子、酶類等的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)，介導(dǎo)或直接參與了腦缺血/再灌注后神經(jīng)元的損傷、死亡。多數(shù)學(xué)者認(rèn)為NF-κB在炎癥反應(yīng)和免疫應(yīng)答中具有重要、關(guān)鍵的地位，是炎癥反應(yīng)的中心環(huán)節(jié)。它已成為干預(yù)腦缺血/再灌注損傷有前景的治療靶點(diǎn)之一。

4、 丁基苯酞(3-n-butylphthalide，NBP)是我國(guó)第3種化學(xué)合成類I類新藥，亦是中國(guó)腦血管研究領(lǐng)域第1項(xiàng)擁有自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)的國(guó)家I類新藥。它主要從我國(guó)南方水芹籽中提取得到，包括三種光學(xué)異構(gòu)體：左旋丁基苯酞(1-NBP)、右旋丁基苯酞(d-NBP)、消旋丁基苯酞(dl-NBP)，其中1-NBP的藥效學(xué)作用更強(qiáng)。經(jīng)大量實(shí)驗(yàn)室研究證明丁基苯酞對(duì)缺血后神經(jīng)元具有保護(hù)作用，多中心I-IV期臨床實(shí)驗(yàn)研究也表明，1-NBP對(duì)急性缺血性腦

5、卒中有明顯療效，具有良好的抗腦缺血活性。因此，我們以1-NBP為干預(yù)藥物，進(jìn)一步研究其對(duì)膠質(zhì)細(xì)胞氧糖剝奪/復(fù)氧后炎性損傷的抑制作用及對(duì)膠質(zhì)細(xì)胞反應(yīng)性增生的抑制作用，并探討其可能機(jī)制；明確1-NBP對(duì)缺血/再灌注后腦膠質(zhì)細(xì)胞的保護(hù)作用；推測(cè)其可能對(duì)膠質(zhì)瘢痕的形成具有一定的抑制作用；預(yù)測(cè)其可能對(duì)其它白質(zhì)炎癥相關(guān)性疾病(多發(fā)性硬化、CNS創(chuàng)傷、C NS感染等)具有一定的治療或輔助治療作用。 目的：(1)探討小鼠腦膠質(zhì)細(xì)胞(glial

6、cell，GC)的培養(yǎng)方法并對(duì)之進(jìn)行形態(tài)學(xué)觀察，免疫細(xì)胞化學(xué)鑒定。 (2)通過(guò)體外細(xì)胞氧糖剝奪/復(fù)氧(oxygen glucose deprivation/reoxygenation，OGD/R)模型研究GC在OGD/R不同時(shí)間段細(xì)胞數(shù)量、活性的變化情況及細(xì)胞內(nèi)NF-κB p65蛋白表達(dá)、活化的規(guī)律。 (3)研究1-NBP對(duì)GC在OGD24h/Rl d后細(xì)胞數(shù)量變化的影響。 (4)研究1-NBP對(duì)OGD24h/R

7、ld后GC內(nèi)IκB-α、NF-κB p65、IL-1β蛋白表達(dá)的影響。 方法：取昆明小鼠乳鼠腦組織，采用機(jī)械吹打分離、篩網(wǎng)過(guò)濾、離心等技術(shù)獲取鼠腦膠質(zhì)細(xì)胞并進(jìn)行培養(yǎng)，通過(guò)倒置顯微鏡、免疫細(xì)胞化學(xué)進(jìn)一步鑒定；采用LDH法、免疫細(xì)胞化學(xué)方法研究和評(píng)價(jià)OGD/R模型，用MTT法確定GC數(shù)量變化最大的OGD/R時(shí)間點(diǎn)；采用Western blot、ELISA方法研究藥物1-NBP作用下OGD/R后GC內(nèi)IκB-α、NF-κB p65以及

8、其下游炎性細(xì)胞因子IL-1β蛋白表達(dá)情況。 結(jié)果：(1)經(jīng)形態(tài)學(xué)、免疫細(xì)胞化學(xué)(GFAP、MAC-1、NSE)鑒定所培養(yǎng)的細(xì)胞為混合培養(yǎng)的星形膠質(zhì)細(xì)胞和小膠質(zhì)細(xì)胞。 (2)OGD前后細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)變化顯著，LDH釋放量增加，并與NC組相比有顯著性差異(p＜0.01)。 (3)免疫細(xì)胞化學(xué)顯示OGD后細(xì)胞核內(nèi)蛋白表達(dá)增加；OGD4h時(shí)開(kāi)始明顯增加，OGD12h時(shí)達(dá)到高峰，OGD24h時(shí)有所下降，但仍高于NC組；OGD

9、12h與OGD24h相比無(wú)顯著性差異(p＞0.05)；OGD各組與NC組相比均有顯著性差異(p＜0.01)。OGD前NF-κB p65弱陽(yáng)性表達(dá)，多在胞漿中可見(jiàn)；OGD后NF-κB p65出現(xiàn)核轉(zhuǎn)位，強(qiáng)陽(yáng)性表達(dá)于胞核，細(xì)胞呈“實(shí)心”現(xiàn)象。 (4)MTT法測(cè)定發(fā)現(xiàn)OGD24h后細(xì)胞數(shù)量減少，與NC組和OGD24h/R各組相比均有顯著性差異(p＜0.05)：OGD24h/R8h、OGD24h/R12h、OGD24h/Rld、OGD2

10、4h/R2d、OGD24h/R3d各時(shí)間段GC數(shù)量逐漸增加，OGD24h/R1d、OGD24h/R2d、OGD24h/R3d與NC組相比有顯著性差異(p＜0.05)。 (5)MTT法測(cè)定發(fā)現(xiàn)正常培養(yǎng)時(shí)I-NBP各組(20μmol/L、100μmol/L、500μmol/L)細(xì)胞數(shù)量與NC組無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(p＞0.05)。1-NBP 1mmol/L組細(xì)胞數(shù)量增多，與NC組相比有顯著性差異(p＜0.01)。PDTC 1 00μmol/

11、L組細(xì)胞數(shù)量減少，與NC組相比有顯著性差異(p＜0.01)。OGD24h/Rld后細(xì)胞數(shù)量增加，1-NBP各組(20μmol/L、1 00μmol/L、500pmol/L)、PDTC 1 00μmol/L組細(xì)胞數(shù)量減少，PDTC100μmol/L組與1-NBP各組相比均有顯著性差異(p＜0.05)。1-NBP500μmol/L組與20μmol/L、100μmol/組組間比較差異顯著(p＜0.05)。 (6)Western blo

12、t條帶顯示，OGD24h/Rld后核內(nèi)NF-κB p65蛋白表達(dá)增加，與NC組相比有顯著差異(p＜0.01)；1-NBP各組(20μmol/L、100μmol/L、500μmol/L)NF-κd3 p65蛋白表達(dá)減少，I-NBP濃度越高NF-κB p65蛋白表達(dá)越少，1-NBP 100μmol/L組、1-NBP 500μmol/L組與OGD24h/R1d組相比有顯著差異(p＜0.01)。PDTC 100μmol/L組NF-κBp65蛋白

13、表達(dá)也減少，與OGD24h/RId組比較有顯著差異(p＜0.01)。1-NBP 500μmol/L組與20μmol/L、1 00μmol/組組間比較差異顯著(p＜0.05)。 (7)Western Blot條帶顯示，OGD24h/Rld后胞漿內(nèi)IκB-α[蛋白表達(dá)減少，與NC組相比有顯著差異(p＜0.01)；1-NBP各組(20μmol/L、1 00μmol/L、500μmol/L)IκB-α蛋白表達(dá)增加，1-NBP濃度越高Iκ

14、B-α蛋白表達(dá)越多，1-Nq3P 100μmol/L、500μmol/L組與OGD24h/Rld組相比有顯著差異(p＜0.01)。PDTC 100μmol/L組IκB-α蛋白表達(dá)也增加，與OGD24h/Rld組比較有顯著差異(p＜0.01)。1-NBP 500μmol/L組與20μmol/L、100μmol/組組間比較差異顯著(p＜0.05)。 (8)ELISA測(cè)定發(fā)現(xiàn)，OGD24h/Rld后IL-1β分泌量增加，與NC組相比有

15、顯著差異(p＜0.05)；1-NBP各組(20μmol/L、1 00μmol/L、500μmol/L)IL-1β表達(dá)減少，1-NBP濃度越高IL-1β表達(dá)越少，1-NBP100μmol/L組、1-NBP 500μmol/L組與NC組比較無(wú)明顯差異(p＞0.05)。PDTC 100μmol/L組IL-1β表達(dá)也減少，與各組比較均有顯著差異(p＜0.01)。 結(jié)論：(1)成功進(jìn)行了小鼠腦星形膠質(zhì)細(xì)胞和小膠質(zhì)細(xì)胞的混合原代培養(yǎng)及鑒定。

16、 (2)對(duì)正常培養(yǎng)GC，1-NBP各濃度組(20μmol/L、100μmol/L、500μmol/L)無(wú)明顯促進(jìn)生長(zhǎng)作用。1-NBP 1mmol/L組有促進(jìn)細(xì)胞生長(zhǎng)作用，PDTC 100μmol/L組有抑制細(xì)胞生長(zhǎng)作用。表明1-NBP對(duì)GC沒(méi)有毒副作用；PDTC對(duì)GC可能有一定毒性作用。 (3)體外細(xì)胞OGD/R模型簡(jiǎn)便有效，OGD后GC數(shù)量減少、活性減弱，NF-κB因子活化入核，OGD12h為其表達(dá)高峰。 (4

17、)OGD24h/R1d后GC出現(xiàn)反應(yīng)性增生。1-NBP和PDTC均能抑制細(xì)胞數(shù)量的增加，1-NBP 500μmol/L組抑制作用較其低濃度組(201μmol/L、100μmol/L)明顯。 (5)OGD24h/Rld后GC內(nèi)IκB-α蛋白降解，NF-κB p65活化入核，1-NBP能通過(guò)抑制IκB-α在胞漿的降解來(lái)減少NF-κB p65入核。1-NBP500μmol/L組抑制作用較其低濃度組(20μmol/L、100μmol/L