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文檔簡介
1、背景:
隨著社會人口老齡化,神經(jīng)退行性疾病的發(fā)病率日益增高,而臨床上,對于這類疾病尚無有效控制病程進展的措施。瑞士研究者發(fā)現(xiàn)神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病與髓鞘脫失有關(guān),進一步研究證明少突膠質(zhì)細胞退化導致脫髓鞘,少突膠質(zhì)細胞對缺血缺氧損傷較其他膠質(zhì)細胞敏感,在大腦的某些特定區(qū)域甚至比神經(jīng)元對缺血缺氧損傷更敏感。因此,有學者提出少突膠質(zhì)細胞的缺血缺氧損傷是神經(jīng)退行性疾病重要原因。
鈣離子是調(diào)節(jié)各個流程的通用第二信使,是細胞間信號傳
2、遞的關(guān)鍵離子,鈣穩(wěn)態(tài)紊亂是缺氧缺血后神經(jīng)細胞死亡諸多途徑的共同節(jié)點。介導外鈣內(nèi)流主要有:電壓依賴的和非電壓依賴的鈣通道兩種方式,瞬時受體電位通道蛋白(transient receptor potential channel,TRPC)是一類非電壓依賴跨膜蛋白,是維持Ca2+穩(wěn)態(tài)的重要離子通道。TRPC在中樞神經(jīng)系統(tǒng)表達廣泛,參與了神經(jīng)系統(tǒng)很多重要的生理功能,其中TRPC3在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中表達最廣泛。研究表明TRPC3異常激活可致神經(jīng)退行
3、性疾病,但是TRPC3是否參與缺血缺氧少突膠質(zhì)細胞的損傷,目前并不清楚。
我們?yōu)檠芯縏RPC3是否參與缺血缺氧少突膠質(zhì)細胞的損傷,本實驗體外培養(yǎng)少突膠質(zhì)細胞,建立少突膠質(zhì)細胞糖氧剝奪(oxygen glucose deprivation,OGD)模型,采用了TRPC3阻斷劑Pyr3阻斷OGD少突膠質(zhì)細胞后,檢測少突膠質(zhì)細胞存活和凋亡的變化及細胞內(nèi)鈣離子濃度的改變。旨在探討 TRPC3是否參與了糖氧剝奪少突膠質(zhì)細胞凋亡,為神經(jīng)退
4、行性疾病的防治提供新的理論依據(jù)和可行的途徑。
方法:
第一部分
1.取SD乳鼠腦皮質(zhì),采用兩種不同的細胞增殖法和兩種不同的分離純化法分四組培養(yǎng),A組為細胞因子增殖聯(lián)合搖床震蕩分離純化法,B組為B104CM(the conditioned medium prepared from B104 neuroblastoma cells,B104CM)增殖聯(lián)合搖床震蕩分離純化法,C組為細胞因子增殖聯(lián)合EDTA消化機械
5、吹打分離純化法,D組為B104CM增殖聯(lián)合EDTA消化機械吹打分離純化法。倒置顯微鏡下觀察神經(jīng)細胞形態(tài)學變化并對各組細胞進行計數(shù)。
2.用A2B5和髓鞘堿性蛋白(myelin basic protein,MBP)檢測其少突膠質(zhì)細胞生物學特性并分析其純度。
3.建立體外少突膠質(zhì)細胞OGD損傷模型的方法:三氣培養(yǎng)箱缺氧、無糖DMEM相結(jié)合的方法,即培養(yǎng)箱調(diào)整為(94%N2+5%CO2+1%O2),培養(yǎng)基更換為無糖DMEM
6、,分別培養(yǎng)1h,2h,3h后取出細胞,更換為正常少突膠質(zhì)細胞培養(yǎng)基,恢復正常的培養(yǎng)條件繼續(xù)培養(yǎng),同時常氧常糖設置為正常對照。
4.細胞活力及凋亡改變的檢測:OGD1h,2h,3h后,恢復正常條件復氧培養(yǎng)24h,MTT比色法測定細胞活力變化;Annexin V-FITC/PI雙染流式細胞術(shù)檢測細胞的凋亡率。比較1h,2h,3h對細胞的損傷程度,確定適合少突膠質(zhì)細胞合適的OGD時間。
第二部分
1.建立體外少突
7、膠質(zhì)細胞OGD損傷模型:采用三氣培養(yǎng)箱物理缺氧與DMEM缺糖相結(jié)合構(gòu)建少突膠質(zhì)細胞OGD損傷模型。
2.采用蛋白質(zhì)免疫印跡法檢測OGD損傷模型少突膠質(zhì)細胞TRPC3蛋白的表達變化。
3.實驗分組:以原代培養(yǎng)的新生SD大鼠少突膠質(zhì)細胞為對照組,以OGD少突膠質(zhì)細胞為模型組,將模型組+Pyr3阻斷組設為處理組。
4.MTT檢測各組細胞活力,AnnexinV-FITC試劑盒染色后經(jīng)流式細胞儀檢測各組細胞凋亡。
8、r> 5.fluo-3染色后經(jīng)流式細胞儀和激光共聚焦顯微鏡測定各組細胞內(nèi)游離鈣的變化。
結(jié)果:
1.B104CM增殖聯(lián)合EDTA消化機械吹打分離純化法較其他三種培養(yǎng)方法收獲的OPC數(shù)量多。
2.少突膠質(zhì)細胞A2B5和MBP特異性標記,細胞純度可達到95%。
3.MTT結(jié)果顯示,OGD1h少突膠質(zhì)細胞細胞活力即降低,隨著缺氧時間延長細胞活力呈降低的趨勢。流式細胞測細胞凋亡的結(jié)果表明
OG
9、D1h、2h、3h,細胞早期凋亡率分別為(14.43±0.20)%、(21.99±0.42)%、(44.71±0.20)%,與正常對照組(6.86±0.05)%相比,均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。
4.OGD損傷模型少突膠質(zhì)細胞TRPC3蛋白表達增加。
5.OGD組細胞活性為(54.34±6.55)%,凋亡率為(24.24±0.86)%,與對照組有顯著差異(P<0.05),Pyr3處理組細胞存活率為(72.26±5
10、.41)%,凋亡率為(14.82±0.28)%,與OGD組有顯著差異(P<0.05)。
6.激光共聚焦測鈣離子濃度結(jié)果顯示,正常對照組熒光強度為(28.89±4.43)%,OGD組熒光強度為(58.05±5.80)%、處理組熒光強度為(42.26±5.44)%,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。流式細胞技術(shù)測定細胞內(nèi)鈣離子濃度結(jié)果顯示,正常對照組熒光強度為(4.15±0.65)%,OGD組熒光強度為(23.99±1.22)%,
11、處理組熒光強度為(10.54±0.73)%,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。兩組結(jié)果均顯示,OGD組細胞內(nèi)鈣水平升高,而加入TRPC3阻斷劑Pyr3后,胞內(nèi)鈣增加得到顯著抑制。
結(jié)論:
1.B104CM增殖聯(lián)合EDTA消化機械吹打分離純化培養(yǎng)法簡單可行,具有穩(wěn)定的可重復性,可用于少突膠質(zhì)細胞的培養(yǎng)。
2.采用三氣培養(yǎng)箱物理缺氧與DMEM缺糖相結(jié)合可有效的構(gòu)建少突膠質(zhì)細胞OGD損傷模型。OGD2h可能是少突
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