鹽酸法舒地爾對體外培養(yǎng)的星形膠質(zhì)細(xì)胞氧糖剝奪損傷的保護(hù)作用和機(jī)制探討.pdf

1、目的：建立星形膠質(zhì)細(xì)胞體外培養(yǎng)方法以及氧糖剝奪（oxygen-glucose deprivation,OGD）模型，研究鹽酸法舒地爾（fasudil hydrochloride，F(xiàn)H）（5μM、10 μM）對體外培養(yǎng)的星形膠質(zhì)細(xì)胞氧糖剝奪損傷的保護(hù)作用及其相關(guān)機(jī)制。
　　 方法：采用新生1~3天SD 大鼠進(jìn)行星形膠質(zhì)細(xì)胞原代培養(yǎng)。待原代細(xì)胞長滿培養(yǎng)瓶底85％~90％時，即可進(jìn)行細(xì)胞傳代。取傳一代后生長至第五天的星形膠質(zhì)細(xì)胞進(jìn)行實(shí)

2、驗(yàn)。應(yīng)用氧清除劑連二亞硫酸鈉（Na2S2O4），聯(lián)合孵育液缺糖的方法建立星形膠質(zhì)細(xì)胞的OGD 損傷模型，通過噻唑藍(lán)（thiazoyl blue tetrazolium bromide，MTT）染色法和檢測乳酸脫氫酶（lactatedehydrogenase，LDH）的釋放量來評價星形膠質(zhì)細(xì)胞受損傷程度，并觀察FH（5μM，10 μM）預(yù)孵育對OGD 損傷的保護(hù)作用。采用高效液相色譜（high performance liquidchro

3、matography，HPLC）熒光檢測法測定培養(yǎng)星形膠質(zhì)細(xì)胞外液中谷氨酸（glumaticacid，Glu）、甘氨酸（glycine，Gly）、?；撬幔╰aurine，Tau）及γ－氨基丁酸（γ－aminobutyricacid，GABA）的含量；利用2',7’-二氯熒光黃雙乙酸鹽（2',7'-Dichlorofluoresceindiacetate，DCFH-DA）熒光探針來檢測星形膠質(zhì)細(xì)胞中活性氧簇（reactive oxygen

4、species，ROS）含量的變化來探討FH 對星形膠質(zhì)細(xì)胞保護(hù)作用的機(jī)制。
　　 結(jié)果：1.MTT分析：以正常對照組細(xì)胞活力為100％，OGD 造模組星形膠質(zhì)細(xì)胞的百分活力下降到正常對照組的24％，兩組間差異有極顯著性意義（p<0.01）；FH 低劑量組與高劑量組星形膠質(zhì)細(xì)胞百分活力分別為正常對照組的41.2％和41.5％，較OGD 造模組均上升，且差異均有極顯著性意義（p<0.01）；但FH 低劑量組和高劑量組間比較無顯著性

5、差異（p>0.05）。2.LDH 釋放量：正常組星形膠質(zhì)細(xì)胞僅有少量LDH 釋放，OGD 造模組星形膠質(zhì)細(xì)胞的LDH 釋放量顯著增加，約為正常對照組的2.1倍，與正常對照組相比差異有極顯著性意義（p<0.01）；FH 低劑量組與高劑量組星形膠質(zhì)細(xì)胞LDH 釋放量與OGD模型組比均下降，且差異均有極顯著性意義（p<0.01）；且 FH 降低LDH 釋放量的作用呈劑量依賴性（p<0.05）。3.星形膠質(zhì)細(xì)胞外液中氨基酸含量測定：OGD造模組

6、四種氨基酸含量較正常組均顯著增高（p<0.01），且興奮性氨基酸Glu 增高的幅度遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于Gly，Tau，GABA 這三種抑制性氨基酸；與OGD 造模組相比，F(xiàn)H 低劑量組和高劑量組細(xì)胞培養(yǎng)外液中氨基酸含量均顯著降低（p<0.01），且Glu 降低最為顯著；但FH 低劑量組和高劑量組間比較無顯著性差異（p>0.05）。4.星形膠質(zhì)細(xì)胞內(nèi)ROS含量的變化：造模組ROS 生成較正常組明顯增多；FH 不同劑量給藥組同造模組相比，可明顯抑制RO