星形膠質(zhì)細(xì)胞條件培養(yǎng)液對(duì)缺氧-復(fù)氧損傷神經(jīng)元的保護(hù)作用及其機(jī)制探討.pdf

1、背景：
　　由于人們物質(zhì)生活得到極大改善，老年人口逐年增加，導(dǎo)致罹患腦血管病人人數(shù)迅速增加，目前腦血管疾病已占我國(guó)致殘和致死性病因第一位，并且患病人數(shù)有逐年增多的趨勢(shì)，而缺血性卒中占腦血管疾病的80％～85％。缺血性卒中不僅對(duì)人類(lèi)健康造成了巨大的威脅，還給患者家庭和社會(huì)帶來(lái)了嚴(yán)重的負(fù)面影響。然而，至今尚無(wú)一種對(duì)所有缺血性卒中有確切療效的治療方法，因此尋找新的治療缺血性卒中的方法非常必要。
　　在研究短暫性腦缺血發(fā)作過(guò)程中，發(fā)

2、現(xiàn)了腦組織的缺血預(yù)處理;缺血預(yù)處理在臨床中是一種不切實(shí)際的治療方法;為了消除缺血造成的創(chuàng)傷，有人提出了藥物預(yù)處理，即通過(guò)藥物激發(fā)或模擬機(jī)體內(nèi)源性物質(zhì)，如腺苷、緩激肽和一氧化氮(nitricoxide，NO)等而發(fā)揮保護(hù)作用。
　　腺苷(adenosine，Ado)及其受體在多種臟器缺血再灌注損傷的保護(hù)方面有重要作用。正常情況下腦細(xì)胞外液腺苷水平為30～300nmol/L，而在腦缺血等病理狀態(tài)下，可達(dá)到5～40umol/L，最多可達(dá)

3、正常時(shí)的200多倍。由此可見(jiàn)，急劇增加的腺苷可能是一種內(nèi)源性的神經(jīng)保護(hù)反應(yīng)。
　　星形膠質(zhì)細(xì)胞(astrocyte，AS)主要存在于在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中，對(duì)神經(jīng)元有支持和營(yíng)養(yǎng)作用。激活后的星形膠質(zhì)細(xì)胞可以釋放多種神經(jīng)遞質(zhì);當(dāng)機(jī)體遇到組織缺血等病理狀態(tài)下時(shí)，星形膠質(zhì)細(xì)胞釋放的物質(zhì)會(huì)明顯增加，保護(hù)受損神經(jīng)元并加速病損神經(jīng)元的功能恢復(fù)。大量的體外細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)也證實(shí)了星形膠質(zhì)細(xì)胞條件培養(yǎng)液（astrocyte-conditionedmediu

4、m，ACM）中含有多種神經(jīng)元營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，提示ACM的確能夠提高損傷神經(jīng)元的存活率并且加快其功能恢復(fù)。雖然星形膠質(zhì)細(xì)胞對(duì)神經(jīng)元的保護(hù)作用已被學(xué)者們公認(rèn)，但其作用機(jī)制不是很清楚，ACM對(duì)受損神經(jīng)元的營(yíng)養(yǎng)作用也需進(jìn)一步探討。
　　本課題利用原代細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)得到星形膠質(zhì)細(xì)胞和神經(jīng)元，建立模擬腦缺血再灌注損傷模型，用ACM、ACMa及ACM+a干預(yù)缺氧損傷的神經(jīng)元;倒置顯微鏡下觀察星形膠質(zhì)細(xì)胞及神經(jīng)元形態(tài)學(xué)變化，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡結(jié)果:X

5、TT法測(cè)定其活性，利用免疫熒光技術(shù)和免疫細(xì)胞化學(xué)技術(shù)分別測(cè)定神經(jīng)元特異性稀醇化酶（neuron-specificenolase，NSE）強(qiáng)陽(yáng)性細(xì)胞的表達(dá)量，各組神經(jīng)元細(xì)胞中caspase-3蛋白表達(dá)及活性檢測(cè)，應(yīng)用Westernblot分析各組神經(jīng)元caspase-3的活性。以此來(lái)分析星形膠質(zhì)細(xì)胞與腺苷對(duì)缺氧/復(fù)氧損傷神經(jīng)元的保護(hù)作用，探討腺苷預(yù)處理后的星形膠質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)液的營(yíng)養(yǎng)性作用，從而進(jìn)一步揭示腺苷對(duì)神經(jīng)系統(tǒng)的保護(hù)機(jī)制，為腺苷應(yīng)用于

6、臨床治療腦血管疾病奠定理論基礎(chǔ)。
　　目的：
　　分析星形膠質(zhì)細(xì)胞與腺苷(adenosine，Ado)對(duì)缺氧/復(fù)氧神經(jīng)元損傷的保護(hù)作用，探討腺苷預(yù)處理后的星形膠質(zhì)細(xì)胞條件培養(yǎng)液的營(yíng)養(yǎng)性作用，從而顯示腺苷對(duì)神經(jīng)系統(tǒng)的保護(hù)機(jī)制，為腺苷應(yīng)用于臨床治療腦血管疾病奠定理論基礎(chǔ)。
　　材料和方法：
　　體外培養(yǎng)SD大鼠大腦皮層星形膠質(zhì)細(xì)胞和海馬神經(jīng)元及大腦皮層神經(jīng)元，純化后建立模擬腦缺血再灌注損傷模型，收集再灌注18h的星形

7、膠質(zhì)細(xì)胞條件培養(yǎng)液(Astrocyteconditionedmedium，ACM)和經(jīng)腺苷預(yù)處理的再灌注18h的星形膠質(zhì)細(xì)胞條件培養(yǎng)液(ACMa)，然后用ACM、ACMa及ACM+a（ACM+含100μmol/L腺苷的DMEM液）以1∶5的濃度培養(yǎng)缺氧/復(fù)氧損傷神經(jīng)元;倒置顯微鏡下觀察星形膠質(zhì)細(xì)胞及神經(jīng)元形態(tài)學(xué)變化，XTT法測(cè)定星形膠質(zhì)細(xì)胞及神經(jīng)元活性，免疫熒光技術(shù)和免疫細(xì)胞化學(xué)技術(shù)分別測(cè)定膠質(zhì)纖維酸性蛋白(glialfibrillar

8、yacidicprotein，GFAP)、NSE強(qiáng)陽(yáng)性細(xì)胞的表達(dá)量，利用ELISA試劑盒進(jìn)行星形膠質(zhì)細(xì)胞乳酸脫氫酶（lactatedehydrogenase，LDH）酶聯(lián)免疫分析，運(yùn)用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡，按Promega公司的CaspACETMAssaySystem，Colorimetric試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行各組神經(jīng)元caspase-3活性測(cè)定，應(yīng)用Westernblot分析各組神經(jīng)元caspase-3的活性。
　　結(jié)果：

9、>　　光鏡觀察:正常組神經(jīng)元生長(zhǎng)良好，形態(tài)規(guī)則，胞體橢圓，折光性好，突觸連接緊密呈網(wǎng)狀;模型組神經(jīng)元胞體變大不規(guī)則，折光性差，突觸明顯減少或消失;ACMa組、ACM+a組及ACM組細(xì)胞狀態(tài)介于兩者之間，總體肉眼觀察，其作用:ACMa＞ACM+a＞ACM。
　　流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡結(jié)果:與正常組相比，模型組、ACMa組、ACM+a組和ACM組細(xì)胞凋亡均顯著增加;而ACMa組、ACM+a組和ACM組細(xì)胞凋亡顯著低于模型組，ACMa組

10、細(xì)胞凋亡顯著低于ACM+a組和ACM組，ACM+a組和ACM組細(xì)胞凋亡無(wú)明顯差異。
　　XTT法細(xì)胞活性檢測(cè):模型組神經(jīng)元活力下降，OD值明顯低于正常對(duì)照組。ACMa組、ACM+a組及ACM組細(xì)胞活力均高于模型組，根據(jù)OD值，其作用:ACMa＞ACM+a＞ACM。
　　NSE的測(cè)定:ACMa組、ACM+a組及ACM組神經(jīng)元表達(dá)NSE的能力均較模型組提高，對(duì)染色結(jié)果陽(yáng)性的細(xì)胞培養(yǎng)片進(jìn)行圖像分析，其作用:ACMa＞ACM+a＞A

11、CM。
　　caspase-3的活性:ACMa組、ACM+a組及ACM組神經(jīng)元caspase-3的活性均較模型組下降，其作用:ACMa＞ACM+a＞ACM。
　　caspase-3活性測(cè)定結(jié)果顯示:與模型組相比，ACMa組、ACM+a組和ACM組神經(jīng)元細(xì)胞中Caspase-3活性均顯著降低;而ACMa組Caspase-3活性低于ACM+a組和ACM組，ACM+a組和ACM組細(xì)胞凋亡無(wú)明顯差異。
　　結(jié)論：
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