梓葛凍干粉針對星形膠質(zhì)細胞缺氧-復(fù)氧損傷的保護作用及其機制研究.pdf

1、背景：梓葛凍干粉針為本團隊自主研發(fā)的中藥單體復(fù)方注射劑，其主要藥效成分為梓醇和葛根素，擬用于缺血性卒中的治療。本團隊在前期的體內(nèi)、外試驗中發(fā)現(xiàn)梓葛凍干粉針對缺血性卒中損傷模型具有保護作用，但其分子機制尚不清楚。本課題觀察了梓葛凍干粉針對體外星形膠質(zhì)細胞缺氧/復(fù)氧損傷模型的保護作用，并闡明了其分子作用機制。本課題獲得了國家自然科學(xué)基金（面上項目81473549，青年項目31402237）、教育部博士學(xué)科點專項基金（博導(dǎo)類：20110182

2、110012）、重慶市衛(wèi)生局中醫(yī)藥科研重大項目（渝中醫(yī)2010[60]2010-1-4）、重慶市基礎(chǔ)與前沿研究計劃項目（cstc2014jcyjA80023）、教育部中央高校基本科研業(yè)務(wù)費（XDJK2014C058）的支持。
　　目的：觀察梓葛凍干粉針對原代培養(yǎng)的SD大鼠大腦皮層星形膠質(zhì)細胞缺氧/復(fù)氧損傷的保護作用，并闡明其發(fā)揮的保護作用的機制。為梓葛凍干粉針的新藥創(chuàng)制提供基礎(chǔ)實驗依據(jù)。
　　方法：
　　1.SD大鼠大

3、腦皮層星形膠質(zhì)細胞的原代分離培養(yǎng)與鑒定無菌分離新生2-3d的SD大鼠乳鼠大腦皮層，經(jīng)消化過濾后，于含10％FBS的DMEM-F12培養(yǎng)基中進行星形膠質(zhì)細胞的培養(yǎng)。待細胞長至融合時，以220rpm的速度于搖床上旋轉(zhuǎn)振蕩18h對細胞進行純化。利用FITC-GFAP并結(jié)合DAPI對星形膠質(zhì)細胞進行免疫熒光鑒定，細胞純度用Image-Pro Plus6.0進行分析。
　　2.星形膠質(zhì)細胞缺氧/復(fù)氧損傷模型的建立及梓葛凍干粉針的保護作用試驗

4、分為正常組、模型組、輔料組（β-環(huán)糊精）以及梓葛凍干粉針12.25μg·mL-1組、24.50μg·mL-1組和49.00μg·mL-1組。每組設(shè)6個復(fù)孔。星形膠質(zhì)細胞缺氧/復(fù)氧損傷模型的建立參照實驗室前期實驗方法，選擇缺氧6h，復(fù)氧12h作為損傷條件。輔料組和藥物組分別在缺氧和復(fù)氧開始時給藥一次。利用倒置顯微鏡觀察細胞損傷前后的形態(tài)變化；同時，在復(fù)氧結(jié)束時后，采用MTT法測定各組細胞的存活率，測定LDH漏出率以評價細胞膜的損傷程度；采

5、用TUNEL熒光染色法細胞凋亡率；并利用Western blot法檢測凋亡相關(guān)蛋白Caspase-9、Caspase-3和PRAP-1等蛋白在細胞中的表達水平。
　　3.梓葛凍干粉針對缺氧/復(fù)氧損傷星形膠質(zhì)細胞炎癥反應(yīng)的抑制作用及其機制研究復(fù)氧結(jié)束后，采用硝酸還原酶法測定各組細胞培養(yǎng)液中NO的釋放量；ELISA法檢測TNF-α、IL-1β及PGE2在細胞培養(yǎng)液中的釋放量；Western blot法檢測細胞中iNOS、COX-2、N

6、F-κB p65，p-NF-κB p65，IκB-α，p-IκB-α及p-IKKα/β等蛋白的表達量。
　　4.梓葛凍干粉針對缺氧/復(fù)氧損傷星形膠質(zhì)細胞氧化應(yīng)激反應(yīng)的抑制作用及其機制研究復(fù)氧結(jié)束后，分別采用黃嘌呤氧化酶法、硫代巴比妥酸顯色法及二硫代二硝基苯甲酸顯色法檢測各組細胞中SOD、MDA和GSH的含量；熒光酶標儀檢測細胞中DCFH-DA探針的熒光強度，以反映細胞中ROS的生成量；并利用Western bolt法檢測Nrf-2

7、和HO-1蛋白在細胞中的表達水平。
　　結(jié)果：
　　1.成功分離培養(yǎng)出原代SD大鼠大腦皮層星形膠質(zhì)細胞星形膠質(zhì)細胞在接種24h內(nèi)完成貼壁，2d后細胞逐漸增殖，并在第3-4d增殖速度最快，第5d時細胞數(shù)量進一步增加，到第6d時細胞已基本鋪滿整個培養(yǎng)瓶底部。細胞搖瓶純化后，經(jīng)GFAP-FITC結(jié)合DAPI免疫熒光鑒定為星形膠質(zhì)細胞，其純度達97%以上。
　　2.梓葛凍干粉針對缺氧/復(fù)氧損傷星形膠質(zhì)細胞具有保護作用與正常組相

8、比，模型組細胞存活率顯著降低，LDH漏出率顯著增高（均P<0.01），細胞胞體劇烈收縮，部分細胞脫落，數(shù)量降低，光澤度降低；同時，模型組細胞凋亡率及Caspase-9和Caspase-3蛋白表達水平均顯著升高，PARP-1含量顯著降低（均P<0.01）。與模型組相比，梓葛凍干粉針12.25μg·mL-1組、24.50μg·mL-1組和49.00μg·mL-1組細胞存活率均顯著升高（均P<0.05），LDH漏出率均顯著降低（均P<0.05

9、），細胞的形態(tài)有所著改善，細胞胞體較舒展，密度增加，光澤度有所恢復(fù)；同時，細胞凋亡率及 Caspase-9和Caspase-3蛋白表達量均顯著降低，PARP-1含量顯著升高（均P<0.05）。
　　3.梓葛凍干粉針可有效抑制缺氧/復(fù)氧損傷星形膠質(zhì)細胞中炎.癥反應(yīng)的發(fā)生與正常組相比，模型組細胞培養(yǎng)液中TNF-α、IL-1β、NO和PGE2的釋放量及細胞iNOS和COX-2蛋白表達量均顯著升高（均P<0.01）。與模型組相比，梓葛凍干

10、粉針12.25μg·mL-1組、24.5μg·mL-1組和49.00μg·mL-1組細胞培養(yǎng)液中IL-1β、NO和PGE2釋放量以及細胞iNOS蛋白表達水平均顯著降低（均P<0.05）；并且梓葛凍干粉針24.50μg·mL-1組和49.00μg·mL-1組細胞培養(yǎng)液中TNF-α釋放量和細胞中COX-2蛋白的表達水平也顯著降低（均P<0.05）。
　　與正常組相比，模型組細胞IKKα/β、IκB-α和NF-κB p65等蛋白的磷酸化

11、水平均顯著升高（均P<0.01）。與模型組相比，梓葛凍干粉針12.25μg·mL-1組、24.50μg·mL-1和49.00μg·mL-1組細胞中NF-κB p65蛋白的磷酸化水平均顯著降低（均P<0.05）。并且梓葛凍干粉針24.50μg·mL-1和49.00μg·mL-1組細胞中 IKKα/β和IκB-α蛋白的磷酸化水平也顯著降低（均P<0.05）。
　　4.梓葛凍干粉針可顯著抑制缺氧/復(fù)氧引起的星形膠質(zhì)細胞氧化應(yīng)激損傷與正常

12、組相比，模型組細胞中ROS和MDA含量顯著升高，同時SOD活性和GSH含量均顯著降低（均 P<0.01）。與模型組相比，梓葛凍干粉針12.25μg·mL-1組、24.50μg·mL-1組和49.00μg·mL-1組細胞中MDA和ROS含量顯著降低，GSH含量顯著升高（均P<0.05）；并且梓葛凍干粉針24.50μg·mL-1組和49.00μg·mL-1組細胞中SOD活性也顯著升高（均P<0.05）。
　　與正常組相比，模型組細胞中

13、Nrf-2和HO-1蛋白的表達水平均出現(xiàn)顯著升高（均P<0.05）。與模型組相比，梓葛凍干粉針12.25μg·mL-1組、24.50μg·mL-1組和49.00μg·mL-1組細胞中Nrf-2和HO-1蛋白的表達水平均出現(xiàn)進一步升高，并具有顯著性差異（均P<0.05）。
　　結(jié)論：
　　1.成功分離培養(yǎng)出原代的SD大鼠大腦皮層星形膠質(zhì)細胞，其純度達97%以上，符合試驗要求。
　　2.梓葛凍干粉針對星形膠質(zhì)細胞的缺氧/復(fù)

14、氧損傷具有保護作用，能夠顯著改善細胞的形態(tài)學(xué)特征，提高損傷細胞的存活率，降低LDH漏出率，并抑制細胞凋亡。
　　3.梓葛凍干粉針可有效抑制缺氧/復(fù)氧損傷星形膠質(zhì)細胞炎癥反應(yīng)的發(fā)生，能夠抑制NF-κB信號通路的激活，顯著降低細胞中炎癥因子的釋放量。
　　4.梓葛凍干粉針可顯著抑制缺氧/復(fù)氧引起的星形膠質(zhì)細胞氧化應(yīng)激損傷，能夠有效抑制氧自由基的產(chǎn)生并促進抗氧化蛋白的生成，其機制可能與藥物能進一步激活Nrf-2/HO-1信號通路有