“腦神經(jīng)血管單元”體外模型的構(gòu)建及梓葛凍干粉對(duì)其缺氧缺糖損傷的保護(hù)研究.pdf

1、針對(duì)單一的細(xì)胞途徑治療缺血性腦損傷效果并不令人滿意，將腦組織的結(jié)構(gòu)和功能單位進(jìn)行整體保護(hù)被認(rèn)為是有效的治療策略，即保護(hù)“腦神經(jīng)血管單元”。“腦神經(jīng)血管單元”是由微血管(這些血管的內(nèi)皮-基質(zhì)-星形細(xì)胞足突復(fù)合體是一個(gè)完整的部分)、血管周圍的星形細(xì)胞突起及由這些突起所支持的神經(jīng)元以及軸突共同組成的復(fù)合體。建立原代3細(xì)胞共培養(yǎng)的“腦神經(jīng)血管單元”體外模型，對(duì)于研究和篩選治療缺血性腦損傷新藥意義重大。
　　 目的:
　　 1.構(gòu)

2、建大鼠腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞、腦星形膠質(zhì)細(xì)胞、腦神經(jīng)元3種腦細(xì)胞原代共培養(yǎng)的整體--“腦血管神經(jīng)單元”體外試驗(yàn)?zāi)Ｐ?，用于腦血管疾病的研究和治療藥物的篩選。
　　 2.利用“腦血管神經(jīng)單元”體外試驗(yàn)?zāi)Ｐ?，觀察梓葛凍干粉針對(duì)“腦神經(jīng)血管單元”的缺血缺氧損傷的整體保護(hù)效果，為創(chuàng)制中藥新藥提供主要藥效學(xué)依據(jù)。
　　 方法:
　　 1.借鑒并改良國(guó)外方法，分別進(jìn)行大鼠腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞、腦星形膠質(zhì)細(xì)胞、腦神經(jīng)元3種腦細(xì)胞原代單細(xì)胞

3、培養(yǎng)，方法如下。(1)分離新生2周左右的SD大鼠乳鼠腦皮層血管內(nèi)皮細(xì)胞，通過(guò)Ⅱ行膠原酶和胰酶配合使用消化組織細(xì)胞，25％牛血清白蛋白分離血管段，采用消化傳代法純化，免疫細(xì)胞化學(xué)和免疫熒光法檢測(cè)內(nèi)皮細(xì)胞特異性蛋白Ⅷ因子以鑒定細(xì)胞純度。(2)分離新生1-2 d內(nèi)的SD大鼠腦星型膠質(zhì)細(xì)胞，采用胰酶消化發(fā)獲得細(xì)胞，差速粘附法和振蕩培養(yǎng)法去除雜細(xì)胞以及免疫細(xì)胞化學(xué)和免疫熒光法檢測(cè)星形膠質(zhì)細(xì)胞特異性酸性膠質(zhì)纖維蛋白GFAP以鑒定細(xì)胞純度。(3)分離

4、新生24 h內(nèi)的SD新生鼠腦皮質(zhì)神經(jīng)元細(xì)胞，采用胰酶消化法和阿糖胞苷抑制劑來(lái)抑制雜細(xì)胞的生長(zhǎng)而純化神經(jīng)元細(xì)胞，后利用免疫細(xì)胞化學(xué)和免疫熒光鑒定神經(jīng)元特異性烯醇化物酶NSE以鑒定細(xì)胞純度。
　　 2、借鑒并改良國(guó)外方法，建立由上述3種腦細(xì)胞共培養(yǎng)所組成的共同體--“腦神經(jīng)血管單元”模型，選用直徑12 mm、微孔孔徑0.4μm、微孔膜面積1.12 mm2的Transwell(12孔，No3401，Corning)小室或者直徑24 m

5、m、微孔孔徑0.4μm、微孔膜面積4.67 mm2的Transwell(6孔，No.3412，Corning)種植3種細(xì)胞，分別于孔板底部最先接種已純化生長(zhǎng)7 d的神經(jīng)元，2 d后于膜的外側(cè)依靠張力作用接種傳代純化后的星形膠質(zhì)細(xì)胞，2 d后于膜的內(nèi)池接種的傳代純化后的血管內(nèi)皮細(xì)胞，相同條件下共培養(yǎng)7 d后。并通過(guò)以下指標(biāo)鑒定“腦血管神經(jīng)單元”體外模型：倒置顯微鏡觀察3種細(xì)胞的生長(zhǎng)狀態(tài)、透射電鏡觀察模型內(nèi)皮細(xì)胞間的精密連接、熒光素鈉(FL

6、U)和辣根過(guò)氧化物酶(HRP)檢測(cè)模型的通透性以及外排系統(tǒng)γ-谷氨酰胺轉(zhuǎn)肽酶(γ-GT)以及細(xì)胞跨膜電阻(TEER)。
　　 3、構(gòu)建“腦神經(jīng)血管單元”缺氧缺糖損傷，并通過(guò)以下指標(biāo)觀察梓葛凍干粉對(duì)其損傷的整體保護(hù)作用，檢測(cè)指標(biāo)包括：westerblot檢測(cè)促紅細(xì)胞生成素(EPO)和促紅細(xì)胞生成素受體(EPOR)以及血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子(VEGF)、軸突生長(zhǎng)蛋白(GAP-43)、髓過(guò)氧化物酶(MPO)、細(xì)胞間赫附分子-1(ICAM

7、-1)、白細(xì)胞介素1(IL-1α)、金屬基質(zhì)酶9(MMP-9)和核因子(NF-κB)P65和(IκB-α)蛋白和神經(jīng)修復(fù)相關(guān)蛋白(TGF-β1)的表達(dá)。免疫酶聯(lián)ELISA法檢測(cè)神經(jīng)細(xì)胞生長(zhǎng)因子β(NGFβ)和炎癥因子如腫瘤細(xì)胞壞死因子(TNF-α)等。
　　 結(jié)果:
　　 1、經(jīng)鑒定證明3種腦細(xì)胞分別原代培養(yǎng)成功。(1)成功分離獲得原代腦血管內(nèi)皮細(xì)胞，傳至3代后免疫細(xì)胞化學(xué)鑒定Ⅷ因子陽(yáng)性細(xì)胞胞漿成棕黃色，計(jì)算得純度達(dá)95

8、％，符合神經(jīng)元原代培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)要求。(2)成功分離獲得原代腦星形膠質(zhì)細(xì)胞，經(jīng)差速貼壁法結(jié)合振蕩搖瓶法處理后傳至3代后免疫細(xì)胞化學(xué)鑒定GFAP陽(yáng)性細(xì)胞胞漿成棕黃色，純度達(dá)90％，符合星形膠質(zhì)細(xì)胞原代培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)要求。(3)成功分離獲得原代腦神經(jīng)元細(xì)胞，經(jīng)阿糖胞苷純化后免疫細(xì)胞化學(xué)鑒定NSE陽(yáng)性細(xì)胞胞漿成棕黃色純度達(dá)85％，符合血管內(nèi)皮細(xì)胞原代培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)要求。
　　 2.試驗(yàn)結(jié)果顯示3種腦細(xì)胞共培養(yǎng)生長(zhǎng)良好，并且具有相互促進(jìn)生長(zhǎng)的作用。經(jīng)檢測(cè)

9、以下指標(biāo)鑒定證明“腦神經(jīng)血管單元”體外模型成功建立。熒光素鈉(FLU)和辣根過(guò)氧化物酶(HRP)通透性分別達(dá)到4632±168.79，3.62±0.14；細(xì)胞跨膜電阻(TEER)值為268.67±4.16(Ω cm2)；細(xì)胞外排系統(tǒng)γ-谷氨酰胺轉(zhuǎn)肽酶(γ-GT)活性為155.33±0.80。相關(guān)檢測(cè)指標(biāo)均符合參考血腦屏障模型評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)。透射電鏡結(jié)果顯示血管內(nèi)皮細(xì)胞存在精密連接。
　　 3.梓葛凍干粉對(duì)缺氧缺糖損傷的“腦神經(jīng)血管單元

10、”中的炎癥因子腫瘤細(xì)胞壞死因子(TNF-α)、細(xì)胞間黏附分子-1(ICAM-1)、白細(xì)胞介素1(IL-1)、金屬基質(zhì)酶9(MMP-9)具有顯著的下調(diào)作用；能顯著促進(jìn)腦微血管內(nèi)皮紅細(xì)胞生成素及其受體(EPO、EPOR)、血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子(VEGF)蛋白表達(dá)；顯著抑制核因子(NF-κB)P65和神經(jīng)修復(fù)相關(guān)蛋白(TGF-β1)以及細(xì)胞凋亡蛋白(casepse-3)的表達(dá)；顯著提高NF-κB抑制蛋白α(IκB-α)表達(dá)。
　　 結(jié)