梓葛凍干粉針的藥代動力學(xué)及改善血腦屏障通透性的機制研究.pdf

1、背景：
　　 梓葛凍干粉針是依據(jù)古方和現(xiàn)代藥理學(xué)研究，自主研發(fā)的中藥單體復(fù)方新藥，已申請國家發(fā)明專利，主要由梓醇和葛根素配伍而成，用于治療腦缺血及其后遺癥。前期藥理學(xué)實驗表明：梓葛凍干粉針能提高腦神經(jīng)血管單元的耐缺氧能力、保護神經(jīng)元；抑制氯化鈷誘導(dǎo)的PC12細胞凋亡；改善局限性永久性腦缺血大鼠腦血流，減輕腦水腫等作用。本課題獲得了重慶市科技攻關(guān)計劃項目(No.CSTC，2010AC5011)；重慶市衛(wèi)生局中醫(yī)藥科技項目(No.2

2、010-2-148)的支持。
　　 目的：
　　 研究梓葛凍干粉針在正常大鼠以及腦缺血模型大鼠的藥代動力學(xué)，考察梓葛凍干粉針在大鼠肝腎分布，探討梓葛凍干粉針對腦缺血模型大鼠血腦屏障通透性的改善作用及其機理，旨在闡明梓葛凍干粉針的藥代動力學(xué)規(guī)律，并為其新藥創(chuàng)制提供依據(jù)。
　　 方法與結(jié)果：
　　 1.梓葛凍干粉針在正常大鼠血漿和腦脊液中的藥代動力學(xué)研究
　　 建立了HPLC-APCI-MS/MS方法

3、測定大鼠血漿和腦脊液中梓醇的含量，HPLC-ESI-MS/MS方法測定大鼠血漿和腦脊液中葛根素的含量。梓醇的測定采用桃葉珊瑚苷為內(nèi)標，流動相為甲醇：20mM醋酸銨水溶液(V/V，50:50)，葛根素測定采用染料木素為內(nèi)標，流動相為0.1％甲酸甲醇：10mM醋酸銨水溶液(V/V，80:20)，流速0.6mL·min-1。運用Agilent6410三重四級桿串聯(lián)質(zhì)譜的多反應(yīng)監(jiān)測(MRM)模式檢測，并進行了方法學(xué)驗證。
　　 結(jié)果顯示

4、，在各生物樣品濃度范圍內(nèi)，均呈良好線性(r>0.990)，大鼠血漿、腦脊液中梓醇的最低定量限分別為10ng·mL-1、20ng·mL-1，葛根素的最低定量限均為20ng·mL-1，高、中、低濃度質(zhì)控樣品的日內(nèi)、日間精密度<15％，日內(nèi)、日間準確度均在±15％范圍內(nèi)，待測物和內(nèi)標的提取回收率基本一致，說明所建立的方法靈敏，準確、可靠，符合生物樣品分析測定的要求。應(yīng)用建立的方法，測定尾靜脈注射梓醇凍干粉針、葛根素凍干粉針和梓葛凍干粉針后，大

5、鼠血漿和腦脊液中梓醇和葛根素的含量，數(shù)據(jù)經(jīng)藥動學(xué)軟件DAS2.1處理，獲得了梓醇和葛根素的血漿和腦脊液藥代動力學(xué)參數(shù)。
　　 結(jié)果表明，在梓葛凍干粉針組，梓醇的血漿和腦脊液達峰濃度(Cmax)分別為23024.4ng·mL-1和415.5ng·mL-1，半衰期(t1/2)為0.369h和1.022h，藥時曲線下面積(AUC(0～5h))為10732.5ng·h·mL-1和395.4ng·h·mL-1，平均滯留時間(MRT(0-∞

6、))為0.437h和1.357h；血漿和腦脊液中葛根素的Cmax分別為56529.4ng·mL-1和899.6ng·mL-1，t1/2為0.311h和0.537h，AUC(0～5h)為17136.3ng·h·mL-1和449.6ng·h·mL-1，MRT(0-∞)為0.273h和0.640h；梓醇和葛根素在腦脊液中的Tmax分別為0.050h和0.080h，梓醇的AUC腦脊液/AUC血漿為4.14％，葛根素的AUC腦脊液/AUC血漿為2

7、.77％。以上數(shù)據(jù)說明，梓葛凍干粉針的藥物成分均可透過正常大鼠血腦屏障，且達峰迅速，這將為確定梓葛凍干粉針的臨床用藥方案提供實驗依據(jù)。
　　 2.梓葛凍干粉針在腦缺血大鼠血漿和腦脊液中的藥代動力學(xué)研究
　　 運用以上建立的HPLC-APCI-MS/MS和HPLC-ESI-MS/MS方法對腦缺血模型大鼠體內(nèi)梓葛凍干粉針的藥代動力學(xué)進行了研究。結(jié)果表明，梓醇的血漿和腦脊液Cmax分別為17523.2ng·mL-1和592.2

8、ng·mL-1，t1/2為0.455h和0.860h，AUC(0～5h)為7165.1ng·h·mL-1和516.3ng·h·mL-1，MRT(0-∞)為0.451h和1.110h；血漿和腦脊液中葛根素的Cmax分別為63243.0ng·mL-1和1812.2ng·mL-1，t1/2為0.755h和0.593h，AUC(0～5h)為20059.8ng·h·mL-1和1011.0ng·h·mL-1，MRT(0-∞)為0.273h和0.38

9、3h；梓醇和葛根素在腦脊液中的Tmax分別為0.083h和0.050h，梓醇的AUC腦脊液/AUC血漿為8.22％，葛根素的AUC腦脊液/AUC血漿為6.96％。說明梓葛凍干粉針能透過腦缺血模型大鼠血腦屏障，且達峰迅速，有利于梓葛凍干粉針發(fā)揮治療作用。
　　 3.梓葛凍干粉針在腦缺血模型大鼠與正常大鼠的藥代動力學(xué)比較
　　 運用單因素方差分析(one-wayANOVA)的LSD-t檢驗進行組間比較，分析結(jié)果表明，模型大鼠

10、血漿中梓醇的Cmax和AUC(0～5h)較正常組顯著降低(P<0.05)，腦脊液中梓醇的Cmax較正常組顯著升高(P<0.05)；模型大鼠血漿中葛根素的t1/2較正常組顯著延長(P<0.05)，腦脊液中葛根素的Cmax和AUC(0～5h)較正常組顯著升高(P<0.05)；與正常大鼠相比，梓醇和葛根素在腦缺血模型大鼠的AUC腦脊液/AUC血漿值均顯著性升高(P<0.05)；其它藥代動力學(xué)參數(shù)無顯著差異(P>0.05)。說明在腦缺血病理狀態(tài)

11、下，腦脊液中梓醇的達峰濃度顯著升高(P<0.05)，葛根素的達峰濃度和總循環(huán)量顯著升高(P<0.05)，梓醇與葛根素的血腦屏障透過率均顯著升高(P<0.05)，這都有利于梓葛凍干粉針治療腦缺血及其后遺癥。
　　 4.梓葛凍干粉針在大鼠肝腎組織的分布
　　 建立了測定大鼠肝腎組織中葛根素含量的HPLC-UV方法，最低定量限為0。375μg·mL-1，標準曲線范圍內(nèi)線性關(guān)系良好(r>0.999)，高、中、低3個濃度下測得日內(nèi)

12、和日間精密度RSD均低于15％，滿足生物樣品分析測定的要求。采用所建立的方法，對尾靜脈注射葛根素凍干粉針和梓葛凍干粉針后大鼠肝腎中葛根素的分布進行了比較研究。
　　 結(jié)果表明，兩種制劑中葛根素在腎臟的Tmax一致，均為10min，MRT(0-∞)也基本一致，約為0.5h；與葛根素凍干粉針組相比，梓葛凍干粉針組腎臟中葛根素Cmax值顯著性降低(P<0.05)，僅為前者的81.54％，AUC(0～2h)值也顯著性降低(P<0.05)

13、，僅為前者的74.46％。說明梓葛凍干粉針組中葛根素的腎臟分布較葛根素凍干粉針組顯著降低(P<0.05)。在肝臟組織中，梓葛凍干粉針組和葛根素凍干粉針組的Cmax值分別為20.9μg·g-1、23.8μg·g-1，AUC(0～2h)值分別為9.5μg·h·g-1、10.1μg·h·g-1，MRT(0-∞)值分別為1.746h、1.455h，兩組間比較無顯著性差異(P>0.05)。說明葛根素與梓醇配伍后，對葛根素的肝臟分布和消除無明顯影響

14、。以上研究結(jié)果從藥代動力學(xué)方面證明，梓醇可降低葛根素在腎臟中的分布，梓葛凍干粉針的腎臟安全性可能更高。
　　 5.梓葛凍干粉針對血腦屏障通透性的影響及其機制
　　 初步研究了梓葛凍干粉針對血腦屏障通透性的影響及其機制。開顱法制備腦缺血模型，設(shè)正常組、模型組和藥物組，模型組與藥物組分別設(shè)1d、3d、7d三個小組，藥物組靜脈給與梓葛凍干粉針(32.7mg/kg)，模型組給予等體積生理鹽水。分別于連續(xù)給藥1、3、7d后，紫外分

15、光光度法測定大鼠腦組織中伊文思藍的含量，考察梓葛凍干粉針對血腦屏障通透性的影響；通過免疫熒光和免疫印跡技術(shù)初步考察梓葛凍干粉針對腦微血管緊密連接相關(guān)蛋白Claudin-5、Occludin、ZO-1的分布和表達的影響。
　　 結(jié)果表明，在連續(xù)給藥7d后，模型組與藥物組腦組織中伊文思藍的含量分別為2.06μg·g-1和0.97μg·g-1，與模型組相比，梓葛凍干粉針能顯著降低腦缺血模型大鼠腦組織中伊文思藍含量(P<0.05)，說明

16、梓葛凍干粉針改善了模型大鼠的血腦屏障通透性。免疫熒光結(jié)果顯示，與正常組相比，模型組腦血管周圍的Claudin-5、Occludin、ZO-1分布不連續(xù)，且隨時間延長，逐漸減少；與模型組相比，隨給藥時間延長，藥物組腦血管周圍Claudin-5、Occludin、ZO-1的分布逐漸連續(xù)，豐富。Westernblot的檢測結(jié)果表明，與正常組相比，在第3d、7d，模型組的Claudin-5、Occludin、ZO-1表達水平顯著降低(P<0.0

17、5)；與模型組相比，在第3d和7d時，藥物組的Claudin-5表達水平顯著升高(P<0.05)，在第3d時，藥物組的Occludin表達水平顯著升高(P<0.05)，在第7d時，藥物組的ZO-1表達水平顯著升高(P<0.05)。以上結(jié)果提示，梓葛凍干粉針降低腦缺血模型大鼠血腦屏障通透性的機制可能與增加腦微血管中緊密連接相關(guān)蛋白Claudin-5、Occludin、ZO-1的分布和表達有關(guān)。
　　 結(jié)論：
　　 1.研究

18、獲得了梓葛凍干粉針在血漿和腦脊液中的藥代動力學(xué)參數(shù)，為確定梓葛凍干粉針的臨床用藥方案提供了參考依據(jù)。
　　 2.梓葛凍干粉針的藥物成分梓醇和葛根素在腦缺血模型大鼠腦脊液中的分布量顯著高于正常組，顯示梓葛凍干粉針用于治療腦缺血易于透過血腦屏障，制劑合理。
　　 3.梓葛凍干粉針中葛根素在腎臟的分布量顯著低于單純葛根素凍干粉針，說明與梓醇配伍后，梓醇降低了葛根素在腎臟的分布，梓葛凍干粉針對腎臟的安全性高于單純葛根素制劑。