器官型腦片糖氧剝奪模型的建立及NBP對此模型細胞凋亡的影響.pdf

1、目的：建立大腦皮層器官型腦片的氧糖剝奪模型(Oxygen andGlucose Deprivation，OGD)，并在此基礎上觀察正丁基苯酞(NBP)對細胞凋亡和線粒體電位的影響。
　　方法：選擇出生后5-7天(P5-7)的SD(Sprague Dawley)乳大鼠，制備大腦皮層運動區(qū)的器官型腦片，采用膜插件的方法進行體外培養(yǎng)，觀察其形態(tài)，并分別于1w，2w，3w，4w時間點進行SMI-32染色，觀察其中的錐體細胞發(fā)育并進行計數。

2、2周后，隨機分為對照組(C組)和實驗組(T0，F0.01，T0.1，T1，T10組)，每組九片，更換含Propidium iodide(PI，1μg/ml)的培養(yǎng)液，孵育20min，倒置熒光顯微鏡下拍照(4X，曝光時間1.038ms，靈敏度ISO1600)后T組采用厭氧罐氧剝奪，更換無糖培養(yǎng)液(含PI)的方式，進行OGD干預30min，后依次更換含不同劑量NBP(0，0.01，0.1，1，10μM)的正常糖含量培養(yǎng)液(含PI)，C組與T

3、組同一時間更換正常培養(yǎng)液。分別在干預前和恢復正常條件1小時后，觀察PI染色。并根據實驗結果，選擇T0組和T10組，分別在不同時間點(OGD30min，NBP1h，24h，72h，7d)同樣條件下拍照。另外C組和T組，進行OGD和NBP干預(培養(yǎng)液不添加PI)，于1h進行JC-1線粒體檢測試劑盒檢測線粒體膜電位的變化。
　　結果：
　　1腦片在體外培養(yǎng)存活良好，無明顯的壞死區(qū)域，鏡下觀察可見腦片體積逐漸增大，變薄，透光度增加，

4、皮層和皮層下結構分界清晰，1、2、3、4周的腦片，進行SMI-32免疫組化染色，可見SMI-32陽性的細胞排列整齊，每個細胞有一個長的頂樹突伸向皮層，并維持穩(wěn)定的數目；
　　2 OGD前后PI染色熒光強度值有明顯變化，并在恢復正常糖氧供應條件后，仍有持續(xù)增強，在72h和7d時的觀察值明顯的升高，各時間點之間及與正常對照組相比均存在明顯差異，差異具有統計學意義(P<0.05)：
　　3器官型腦片OGD30min后，對照組(C組

5、)和實驗組(T0，T0.01，T0.1，T1，T10組)，PI染色可見不同亮度的紅色熒光，與正常對照組相比，實驗組各亞組的熒光強度均大于對照組，各組紅色熒光強度依次增強，與NBP濃度(0-10μM范圍內)呈負相關，實驗組與對照組及實驗組各亞組之間差異均有統計學顯著性(P<0.05)：
　　4 T0組和T10組，分別觀察不同時間點(OGD30min，NBP+再灌注1h，24h，72h，7d)PI染色，可見兩組在OGD30min后均出

6、現了明顯的細胞凋亡，兩組無顯著性差異。T0組隨時間的延長細胞凋亡明顯增加，在72h和7d時的觀察值明顯的升高。然而NBP組隨時間的延長，PI染色逐漸減少，各組之間的差異均具有統計學意義(P<0.05)：
　　5對照組(C組)和實驗組(T0，T0.01，T0.1，T1，T10組)(培養(yǎng)液不添加PI)，JC-1線粒體檢測試劑盒染色可見OGD30min，復氧復糖1h后，紅色熒光/綠色熒光(R/G)的值明顯減小，R/G的值與NBP濃度呈正

7、相關，實驗組各亞組的R/G的值均小于對照組，實驗組與對照組及實驗組各亞組之間差異均有統計學顯著性(P<0.05)；
　　結論：
　　1 SD大鼠P5-7乳鼠可以作為體外腦片培養(yǎng)的供體；
　　2體外培養(yǎng)的大腦皮層器官型腦片具有與體內類似的細胞結構，錐體細胞分布，可以作為研究外界刺激對皮層神經元影響的各種模型制作的平臺；
　　3 OGD模型操作方便，能夠誘導腦片損傷，出現細胞的急性死亡和遲發(fā)性凋亡，模擬了缺血性腦損傷