烏司他丁預(yù)處理對氧糖剝奪誘導(dǎo)的GEs-1細(xì)胞損傷的影響.pdf

1、背景：
　　急性胃粘膜損傷(AGML)是臨床上常見的圍術(shù)期并發(fā)癥，其具體的發(fā)病機制至今仍未完全明確。目前普遍認(rèn)為胃粘膜缺血是AGML發(fā)病的主要環(huán)節(jié)。課題組前期已通過大鼠的浸水束縛應(yīng)激模型，分別從損傷性應(yīng)激和非損傷的心理應(yīng)激等層面探討了AGML的發(fā)病進程。然而卻一直未從缺血的角度探討AGML的發(fā)生機制及可能的防護措施。烏司他丁(UTI)作為一種廣譜尿胰蛋白酶抑制劑，具有減少氧自由基、穩(wěn)定溶酶體膜、減輕炎癥、改善循環(huán)等作用。研究表明U

2、TI對危重患者腸粘膜具有保護作用，但其對胃粘膜是否也有保護作用尚無報道。
　　目的：
　　本研究采用人胃粘膜上皮細(xì)胞株(GES-1)，運用氧糖剝奪(OGD)方法來構(gòu)建細(xì)胞的缺氧缺糖模型，單純從“缺血”角度研究胃粘膜損傷的機制，并觀察UTI預(yù)處理是否對損傷的細(xì)胞有保護作用。
　　方法：
　　1.構(gòu)建GES-1細(xì)胞株的OGD模型:采用無糖培養(yǎng)基和三氣培養(yǎng)箱對GES-1細(xì)胞給予不同的OGD時間(0、2、4、6、8h)，

3、用CCK-8法檢測細(xì)胞活力，Hoechst染色法和流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡，免疫印跡法檢測Bcl-2，Bax蛋白的表達;
　　2.摸索UTI合適的作用濃度:將GES-1細(xì)胞按順序分別加入濃度為0、100、200、400、800、1000U/mL的UTI，作用12h后進行CCK-8法檢測，發(fā)現(xiàn)1000U/ml組細(xì)胞存活率較0U/ml組明顯下降(P＜0.01)，而其余組細(xì)胞存活率無明顯變化。故在OGD損傷6h前，去掉1000U/ml濃度

4、組，將細(xì)胞隨機分為正常對照組、氧糖剝奪組、不同濃度UTI預(yù)處理組(UTI濃度分別為100、200、400、800U/mL)，處理后用CCK-8法檢測;
　　3.探索UTI減輕GES-1細(xì)胞OGD損傷的機制:GES-1細(xì)胞隨機分為正常對照組（N組）、氧糖剝奪組（O組）、UTI預(yù)處理組（U組）。N組不做任何處理，O組和U組細(xì)胞均進行OGD處理6h，且U組細(xì)胞在OGD前先用800U/mlUTI提前作用12h。處理后，用CCK-8法測定細(xì)

5、胞活力，流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡，免疫印跡法檢測Caspase-3和Cleaved Caspase-3的蛋白表達水平，實時熒光定量PCR法檢測細(xì)胞內(nèi)TRPV1mRNA的表達水平。
　　結(jié)果：
　　1.檢測結(jié)果顯示，隨著OGD時間的延長，細(xì)胞活力明顯下降，凋亡細(xì)胞明顯增多，凋亡率顯著上升，凋亡相關(guān)蛋白Bax/Bcl-2比值逐漸增加(P＜0.01或P＜0.05)。
　　2.與氧糖剝奪組比較，細(xì)胞存活率在UTI濃度提高到400

6、U/ml和800U/ml時明顯增加，且在UTI濃度為800U/ml時細(xì)胞存活率最高(P＜0.01)。
　　3.結(jié)果顯示，與N組比較，O組細(xì)胞存活率顯著降低，凋亡率增加，Caspase-3和Cleaved Caspase-3表達增加，TRPV1mRNA表達降低(P＜0.05);而UTI預(yù)處理能顯著抑制上述O組的變化，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。
　　結(jié)論：
　　利用無糖培養(yǎng)基和三氣培養(yǎng)箱可成功構(gòu)建GES-1細(xì)胞的OGD模型，能較