TNF-α調(diào)節(jié)星形膠質(zhì)細(xì)胞EAAT2的表達(dá)和對(duì)氧糖剝奪神經(jīng)元存活率的影響.pdf

1、背景
　　 急性缺血性腦梗塞以其發(fā)病率高、死亡率高而嚴(yán)重危害著人類健康。谷氨酸積聚所致的興奮毒性和炎性反應(yīng)被認(rèn)為分別是腦缺血損傷的重要機(jī)制之一。腦內(nèi)清除谷氨酸的主要機(jī)制是谷氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)體EAAT將胞外谷氨酸重?cái)z取至胞內(nèi)，以終止谷氨酸的神經(jīng)興奮作用。星形膠質(zhì)細(xì)胞膜上表達(dá)大量的EAAT2，參與了大部分的胞外谷氨酸的清除，但在缺血缺氧等條件下其功能表達(dá)會(huì)發(fā)生顯著變化，從而導(dǎo)致谷氨酸興奮性毒性。所以，探討腦缺血時(shí)何種因素導(dǎo)致EAAT2的表達(dá)

2、改變，從而通過增強(qiáng)EAAT2表達(dá)功能有可能促進(jìn)缺血神經(jīng)元的存活。
　　 腦缺血時(shí)星形膠質(zhì)細(xì)胞和小膠質(zhì)細(xì)胞會(huì)釋放很多細(xì)胞因子，其中腫瘤壞死因子TNF-α是主要因子之一，缺氧使TNF-α顯著增加。有文獻(xiàn)報(bào)道TNF-α可能參與了EAAT2的表達(dá)下調(diào)，但也有文獻(xiàn)提出TNF-α可以促進(jìn)EAAT2的功能，分析其中的原因可能是忽略了TNF-α對(duì)膠質(zhì)增生的作用，以及缺少TNF-α的時(shí)間和濃度效應(yīng)。針對(duì)以上缺陷，本研究探討了不同濃度及作用時(shí)間的T

3、NF-α對(duì)星形膠質(zhì)細(xì)胞EAAT2以及膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)記物GFAP表達(dá)的影響。
　　 目的
　　 探討TNF-α調(diào)控星形膠質(zhì)細(xì)胞EAAT2表達(dá)的時(shí)間和濃度效應(yīng)；闡明TNF-α是否有可能保護(hù)缺血神經(jīng)元。
　　 方法
　　 (1)分別取SD大鼠新生鼠大腦皮層和胎鼠的海馬組織做星形膠質(zhì)細(xì)胞純培養(yǎng)和神經(jīng)元純培養(yǎng)，或者采用倒扣法將二者混合培養(yǎng)。
　　 (2)外源性TNF-α采用不同濃度和作用時(shí)間孵育星形膠質(zhì)細(xì)胞。<

4、br>　　 (3)將混合培養(yǎng)的細(xì)胞氧糖剝奪(OGD)2小時(shí)處理，再復(fù)灌24小時(shí)后做細(xì)胞活性及蛋白表達(dá)測(cè)定。
　　 (4)采用MTT檢測(cè)法測(cè)定神經(jīng)元存活度。
　　 (5)采用Western Blot法分別檢測(cè)星形膠質(zhì)細(xì)胞EAAT2和GFAP蛋白表達(dá)量的變化。
　　 結(jié)果
　　 (1)在低濃度的TNF-α作用下(≤10ng/ml)，星形膠質(zhì)細(xì)胞EAAT2的蛋白表達(dá)量隨濃度逐漸增加，在10ng/ml的TNF-

5、α作用時(shí)表達(dá)增加最顯著；但在高濃度的TNF-α作用下(≥20ng/ml)，EAAT2蛋白表達(dá)量又從高峰逐漸下降，而GFAP表達(dá)量在各濃度TNF-α作用下都無明顯改變。提示了低濃度的TNF-α可以促進(jìn)EAAT2的表達(dá)，并且這種促進(jìn)作用不是歸因于膠質(zhì)細(xì)胞的增生。
　　 (2)星形膠質(zhì)細(xì)胞經(jīng)10ng/ml的TNF-α孵育，在孵育24h以內(nèi)，EAAT2的蛋白表達(dá)量隨孵育時(shí)間逐漸增高，其中在孵育8h，12h和24h后均能顯著促進(jìn)EAAT2

6、的表達(dá)；而隨著TNF-α更長(zhǎng)時(shí)間的孵育(≥24h)，EAAT2的表達(dá)從高峰又逐漸下降。GFAP蛋白表達(dá)量在TNF-α作用的各時(shí)間點(diǎn)都無明顯差異。提示了TNF-α孵育早期可以促進(jìn)EAAT2的表達(dá)，而長(zhǎng)時(shí)間的TNF-α孵育反而會(huì)抑制EAAT2的表達(dá)，這種促進(jìn)或抑制作用不是歸因于膠質(zhì)細(xì)胞的增生。
　　 (3)OGD嚴(yán)重?fù)p傷了神經(jīng)元。但是星形膠質(zhì)細(xì)胞經(jīng)低濃度TNF-α短期孵育，采用倒扣混合培養(yǎng)法增強(qiáng)了神經(jīng)元對(duì)OGD損傷的抵抗作用，但保護(hù)

7、作用的時(shí)間點(diǎn)與EAAT2表達(dá)增強(qiáng)的時(shí)間點(diǎn)并不吻合。
　　 (4)OGD條件下，星形膠質(zhì)細(xì)胞經(jīng)不同濃度的TNF-α短時(shí)孵育后，EAAT2表達(dá)量?jī)H輕度升高，升高程度不及非OGD條件下的顯著，并且，EAAT2表達(dá)的升高伴隨著GFAP表達(dá)的升高。說明OGD條件下，TNF-α并不能有效升高EAAT2的表達(dá)，它增強(qiáng)OGD后神經(jīng)元的抵抗作用可能不完全歸因于它對(duì)EAAT2的調(diào)控作用。
　　 結(jié)論
　　 低濃度的TNF-α短時(shí)孵育