肌肽對星形膠質(zhì)細(xì)胞及神經(jīng)元能量代謝的調(diào)節(jié)作用.pdf

1、目的：
　　1.闡述生理及缺血條件下原代新生大鼠皮層星形膠質(zhì)細(xì)胞的生物能量學(xué)特征。
　　2.探討肌肽對生理及缺血條件下星形膠質(zhì)細(xì)胞能量代謝的調(diào)節(jié)作用。
　　3.闡明生理條件下肌肽對原代新生大鼠皮層神經(jīng)元/星形膠質(zhì)細(xì)胞共培養(yǎng)模型能量代謝的影響。
　　4.探究缺糖缺氧再灌注后肌肽處理對共培養(yǎng)體系能量代謝的調(diào)節(jié)作用。
　　方法：
　　1.利用海馬生物能量代謝檢測儀實時監(jiān)測細(xì)胞氧耗率(OCR)與胞外酸化率(E

2、CAR)，獲得一系列與氧化磷酸化和糖酵解有關(guān)的指標(biāo)，從而來研究正常培養(yǎng)條件及體外缺糖缺氧(OGD)8 h再灌注(Recovery)24h/48h模型中皮層星形膠質(zhì)細(xì)胞的生物能量學(xué)特征。
　　2.正常培養(yǎng)條件下5 mM肌肽處理星形膠質(zhì)細(xì)胞24/48h，利用海馬生物能量儀研究其對星形膠質(zhì)細(xì)胞能量代謝的影響。同時觀察OGD/R24 h及OGD/R48 h條件下5 mM肌肽預(yù)處理對星形膠質(zhì)細(xì)胞能量代謝是否具有促進(jìn)恢復(fù)作用。
　　3.

3、ATP試劑盒檢測正常培養(yǎng)條件下、肌肽處理24 h以及OGD/R24 h模型肌肽預(yù)處理后星形膠質(zhì)細(xì)胞胞內(nèi)ATP濃度的變化。
　　4.流式細(xì)胞儀分析肌肽處理24 h和OGD/R24 h模型中肌肽對星形膠質(zhì)細(xì)胞存活的影響。
　　5.MTT還原法檢測OGD/R24 h模型中肌肽對星形膠質(zhì)細(xì)胞存活率的影響。
　　6.海馬生物能量代謝儀檢測增加丙酮酸鈉濃度對肌肽下調(diào)星形膠質(zhì)細(xì)胞的能量代謝的影響。
　　7.海馬生物能量代謝儀檢

4、測正常培養(yǎng)條件下原代皮層神經(jīng)元/星形膠質(zhì)細(xì)胞共培養(yǎng)體系，5 mM肌肽處理2h及24h后，共培養(yǎng)細(xì)胞能量代謝的變化。
　　8.海馬生物能量代謝儀檢測OGD/R0 h，OGD/R2 h模型中肌肽處理對共培養(yǎng)細(xì)胞能量代謝的調(diào)節(jié)。
　　9.Hoechst33342和PI核雙染法鑒定肌肽能否減少共培養(yǎng)體系OGD/R損傷所引起的神經(jīng)元死亡。
　　10.熒光定量PCR檢測缺糖缺氧再灌注條件下肌肽處理后共培養(yǎng)體系MCT1、MCT2、M

5、CT4的表達(dá)。
　　結(jié)果：
　　1.在生理條件下，星形膠質(zhì)細(xì)胞的基礎(chǔ)氧耗率(Basal OCR)和基礎(chǔ)胞外酸化率(Basal ECAR)分別為21.72±1.59 pmole/min/μg protein和3.95±0.28mpH/min/μg protein。其中線粒體呼吸占細(xì)胞呼吸總量的80％，并且線粒體呼吸中有85％用來合成ATP。
　　2.肌肽能顯著下調(diào)星形膠質(zhì)細(xì)胞的Basal OCR和Basal ECAR，以

6、及與ATP產(chǎn)生有關(guān)的氧耗值，但同時它也能顯著增加星形膠質(zhì)細(xì)胞的儲備呼吸。
　　3.肌肽處理顯著下調(diào)星形膠質(zhì)細(xì)胞胞內(nèi)ATP水平，由正常對照組的100％降低到42％。
　　4.在缺糖缺氧條件下，肌肽可以上調(diào)星形膠質(zhì)細(xì)胞線粒體呼吸以及胞內(nèi)ATP含量。
　　5.在缺糖缺氧條件下，肌肽對星形膠質(zhì)細(xì)胞的存活率并無影響。
　　6.增加測試液內(nèi)丙酮酸濃度并不能逆轉(zhuǎn)肌肽對星形膠質(zhì)細(xì)胞能量代謝的抑制作用。
　　7.肌肽下調(diào)正常

7、培養(yǎng)條件下原代皮層神經(jīng)元/星形膠質(zhì)細(xì)胞共培養(yǎng)體系能量代謝。
　　8.在缺糖缺氧條件下，肌肽可以顯著上調(diào)共培養(yǎng)體系線粒體氧化磷酸化水平。
　　9.Hoechst及PI雙染結(jié)果顯示肌肽降低原代皮層神經(jīng)元/星形膠質(zhì)細(xì)胞缺糖缺氧再灌注損傷引起的神經(jīng)元死亡。
　　10.熒光定量PCR的結(jié)果顯示缺糖缺氧條件肌肽能下調(diào)MCT1的表達(dá)。
　　結(jié)論：
　　1.肌肽具有調(diào)節(jié)星形膠質(zhì)細(xì)胞及共培養(yǎng)體系細(xì)胞能量代謝的作用;