全麻過(guò)程中腦內(nèi)ERK1-2和PKC的活性變化及其可能作用.pdf

1、全身麻醉應(yīng)用于臨床已有160多年的歷史，但全麻藥的作用機(jī)理迄今還不完全清楚。全麻藥物是如何引起機(jī)體意識(shí)喪失、遺忘、制動(dòng)等全麻效應(yīng)的？全麻藥物作用的中樞靶點(diǎn)是什么？仍是未解之謎。多年來(lái)，科學(xué)界從整體、細(xì)胞和分子等不同水平對(duì)此進(jìn)行了不懈的探索。雖然這些研究還遠(yuǎn)未闡明問(wèn)題的實(shí)質(zhì)，但已肯定的是：全麻藥物是通過(guò)作用于中樞神經(jīng)系統(tǒng)而產(chǎn)生意識(shí)喪失、遺忘和制動(dòng)等麻醉效應(yīng)的。
　　細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)分子分布廣泛，反應(yīng)迅速，調(diào)控著細(xì)胞的各項(xiàng)生理功能。細(xì)胞

2、外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶（ERK1/2）是一種重要的細(xì)胞內(nèi)信號(hào)調(diào)節(jié)分子，在神經(jīng)系統(tǒng)中表達(dá)廣泛，當(dāng)細(xì)胞受到外界刺激時(shí)其磷酸化（pERK1/2）水平會(huì)發(fā)生快速變化。本實(shí)驗(yàn)室既往的研究發(fā)現(xiàn)，吸入全麻藥異氟醚和七氟醚可以引起小鼠腦內(nèi)一些部位和核團(tuán)的pERK1/2明顯增強(qiáng)或減弱，并且這種改變與動(dòng)物的麻醉-清醒過(guò)程之間存在著高度的一致性，提示這些腦區(qū)內(nèi)ERK1/2磷酸化與全麻的產(chǎn)生或效應(yīng)之間可能有密切的關(guān)系。本研究的第一部分在前期觀察了吸入麻醉誘發(fā)腦內(nèi)pER

3、K1/2變化的工作基礎(chǔ)上，進(jìn)一步觀察了異丙酚、氯胺酮靜脈麻醉對(duì)腦內(nèi)pERK1/2的影響，以圖發(fā)現(xiàn)與吸入和靜脈麻醉相關(guān)的腦內(nèi)核團(tuán)的共性和區(qū)別，籍以為篩查與全麻效應(yīng)相關(guān)的腦內(nèi)核團(tuán)提供線索。在此基礎(chǔ)上，本研究的第二部分，我們選擇在三種藥物全麻時(shí)pERK1/2水平都明顯變化的核團(tuán)——EW核和杏仁中央核，用免疫熒光雙標(biāo)和腦內(nèi)核團(tuán)毀損方法，探討了這些核團(tuán)在全身麻醉的產(chǎn)生和/或效應(yīng)中有無(wú)作用，為尋找全麻藥中樞作用的可能靶位積累資料。蛋白激酶C（PKC

4、）是另一種重要的細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)分子，調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)許多重要的生理功能。既往許多離體研究發(fā)現(xiàn)，PKC可能是全麻藥中樞作用的一種潛在靶分子，因而在本研究的第三部分，我們通過(guò)觀察PKC抑制劑白屈菜紅堿對(duì)小鼠七氟醚麻醉效應(yīng)的影響，了解PKC在全身麻醉中的具體作用。SynapsinⅠ（突觸蛋白Ⅰ）是一種突觸囊泡相關(guān)蛋白，其多個(gè)位點(diǎn)受蛋白激酶磷酸化，通過(guò)磷酸化和去磷酸化調(diào)節(jié)神經(jīng)遞質(zhì)的釋放。那么，全麻藥是否通過(guò)調(diào)節(jié)synapsinⅠ的磷酸化從而調(diào)節(jié)神經(jīng)遞

5、質(zhì)的釋放呢？在本研究的第四部分，我們初步觀察了七氟醚麻醉對(duì)小鼠大腦感覺運(yùn)動(dòng)皮質(zhì)區(qū)synapsinⅠ磷酸化的影響，以了解全麻藥對(duì)突觸傳遞的作用。
　　第一部分，靜脈全麻藥對(duì)小鼠腦內(nèi)pERK1/2表達(dá)的影響
　　1.異丙酚、氯胺酮及七氟醚麻醉小鼠腦內(nèi)pERK1/2表達(dá)變化的比較
　　60只成年雄性BALB/c小鼠,隨機(jī)分為未麻醉對(duì)照組和異丙酚、氯胺酮和七氟醚麻醉組。對(duì)照組吸入純氧5min后直接脫臼處死；異丙酚及氯胺酮麻醉組

6、分別腹腔注射異丙酚或氯胺酮100mg/kg后純氧吸入。七氟醚組以1MAC吸入30min后用高流量氧洗脫。分別于清醒狀態(tài)和麻醉5min、麻醉后清醒5min及麻醉后清醒1h脫臼處死，灌注固定后取腦切片，免疫組織化學(xué)染色，觀察并對(duì)比三種全麻藥在麻醉的不同時(shí)間點(diǎn)腦內(nèi)pERK1/2表達(dá)水平的變化。
　　結(jié)果發(fā)現(xiàn)：三種全麻藥麻醉-清醒過(guò)程中，小鼠腦內(nèi)pERK1/2陽(yáng)性細(xì)胞變化部位大致相似。麻醉時(shí)ERK1/2磷酸化發(fā)生抑制的部位主要為海馬和廣泛

7、的皮質(zhì)區(qū)域，對(duì)照組小鼠腦內(nèi)一些pERK1/2陽(yáng)性細(xì)胞分布較多的部位如感覺運(yùn)動(dòng)皮質(zhì)、嗅周皮質(zhì)、梨狀皮質(zhì)、扣帶皮質(zhì)等，陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)在異丙酚、氯胺酮和七氟醚麻醉5min后均較對(duì)照組明顯減少（P＜0.05）。清醒5min后，pERK1/2陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)均有所回升（與麻醉5min組相比，P＜0.05）；清醒1h后恢復(fù)到對(duì)照組水平（與清醒對(duì)照組比P＞0.05）。海馬pERK1/2陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)在三種藥物麻醉后均明顯減少，七氟醚組清醒5min后即恢復(fù)正常，但異

8、丙酚和氯胺酮組清醒1h仍未恢復(fù)。另一方面，ERK1/2磷酸化增強(qiáng)的主要是皮質(zhì)下核團(tuán)，對(duì)照組中一些pERK1/2無(wú)表達(dá)或低表達(dá)的皮質(zhì)下核團(tuán)如杏仁中央核、臂旁外側(cè)核、延髓腹外側(cè)網(wǎng)狀核、視上核和EW核在三種藥物麻醉5min后pERK1/2陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)均較對(duì)照組明顯升高（P＜0.01），清醒5min后明顯回落，清醒1h已恢復(fù)至對(duì)照組水平（與對(duì)照組比P＞0.05）。
　　此外，三種全麻藥物麻醉時(shí)腦內(nèi)pERK1/2表達(dá)增強(qiáng)的皮質(zhì)下核團(tuán)不盡相同。

9、異丙酚麻醉時(shí)韁外側(cè)核（LHb）陽(yáng)性細(xì)胞明顯增多，清醒后恢復(fù)，而氯胺酮和七氟醚無(wú)此變化；氯胺酮麻醉時(shí)丘腦室旁核的pERK1/2陽(yáng)性細(xì)胞激活較異丙酚和七氟醚麻醉時(shí)更為明顯。另外更重要的是，兩種靜脈全麻藥異丙酚和氯胺酮麻醉時(shí)下丘腦腹內(nèi)側(cè)核腹外側(cè)部（VMHvl）陽(yáng)性細(xì)胞激活增多，而吸入全麻藥七氟醚麻醉時(shí)未見此種變化。
　　2.pERK1/2與GABA能神經(jīng)元的關(guān)系
　　取對(duì)照組和異丙酚麻醉5min組小鼠全腦切片，每組三只小鼠，每只小

10、鼠取一套腦片。作pERK1/2與GABA能神經(jīng)元標(biāo)志物GAD67的免疫熒光雙標(biāo)記。結(jié)果發(fā)現(xiàn)：對(duì)照組、異丙酚麻醉5min組皮質(zhì)和海馬有很少pERK1/2和GAD67雙標(biāo)陽(yáng)性神經(jīng)元，麻醉時(shí)皮質(zhì)下pERK1/2陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)增多的各個(gè)腦區(qū)和核團(tuán)未發(fā)現(xiàn)雙標(biāo)陽(yáng)性細(xì)胞。
　　第二部分，EW及杏仁中央核在全麻效應(yīng)中的可能作用
　　1.pERK1/2與urocortin神經(jīng)元的關(guān)系
　　分別取異丙酚、氯胺酮和七氟醚麻醉5min組小鼠中腦部

11、位切片，每組三只小鼠，片厚40μm，作pERK1/2和urocortin免疫熒光雙標(biāo)記。
　　結(jié)果發(fā)現(xiàn)：在異丙酚、氯胺酮和七氟醚麻醉5min小鼠腦片上，中腦EW核內(nèi)存在大量的pERK1/2和urocortin雙標(biāo)陽(yáng)性神經(jīng)元，提示urocortin神經(jīng)元可能參與麻醉效應(yīng)。
　　2.毀損EW核或杏仁中央核對(duì)全麻效應(yīng)的影響
　　雄性SD大鼠，體重280-300g，在立體定位儀上行EW核和杏仁中央核直流電毀損。術(shù)后5天分別接受

12、異丙酚、氯胺酮和七氟醚麻醉，測(cè)量動(dòng)物翻正反射消失時(shí)間和翻正反射恢復(fù)時(shí)間。行為學(xué)測(cè)定結(jié)束后，動(dòng)物灌注固定取腦，毀損部位切片HE染色。根據(jù)毀損情況分別進(jìn)行EW和CeA核毀損成功和毀損失敗統(tǒng)計(jì)。另取12只大鼠不毀損核團(tuán)，僅給予麻醉，作為空白對(duì)照。
　　結(jié)果發(fā)現(xiàn)：毀損杏仁中央核后，異丙酚和氯胺酮麻醉大鼠翻正反射的消失時(shí)間與毀損對(duì)照組相比無(wú)顯著性差異（P＞0.05）；與毀損對(duì)照組相比，杏仁中央核毀損大鼠翻正反射的恢復(fù)時(shí)間在異丙酚麻醉組縮短（

13、P<0.01），而氯胺酮組無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。毀損大鼠杏仁中央核對(duì)七氟醚麻醉大鼠的翻正反射消失時(shí)間和恢復(fù)時(shí)間均無(wú)明顯影響。
　　大鼠EW核毀損后異丙酚麻醉的翻正反射消失時(shí)間較毀損對(duì)照延長(zhǎng)（P<0.01），而氯胺酮組無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異；EW核毀損后大鼠翻正反射的恢復(fù)時(shí)間在氯胺酮麻醉組有所縮短（P<0.05），而異丙酚組無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。大鼠EW核毀損后七氟醚麻醉的翻正反射消失和恢復(fù)時(shí)間與毀損對(duì)照組相比均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。
　　第三部分，蛋白激酶C

14、在七氟醚麻醉效應(yīng)中的可能作用
　　75只雄性BALB/c小鼠，隨機(jī)分為對(duì)照組和白屈菜紅堿（CHE）2.5、5、10、20mg/kg組，每組15只。分別給予腹腔注射DMSO或CHE2.5～20mg/kg。腹腔注射后45min，每組取三只作皮層和海馬pPKCγ的Westernblotting檢測(cè)，其余動(dòng)物測(cè)定七氟醚麻醉的翻正反射消失時(shí)間（LORR）和夾尾反射恢復(fù)時(shí)間。
　　結(jié)果：Westernblotting分析表明應(yīng)用白屈菜紅

15、堿后小鼠大腦感覺運(yùn)動(dòng)皮質(zhì)區(qū)域pPKCγ較對(duì)照組表達(dá)降低（P<0.01）。與對(duì)照組比較，腹腔注射白屈菜紅堿5mg/kg，10mg/kg和20mg/kg組七氟醚麻醉小鼠翻正反射消失時(shí)間（LORR）縮短（P<0.01），夾尾反射恢復(fù)時(shí)間延長(zhǎng)（P<0.01）。
　　第四部分，七氟醚麻醉對(duì)小鼠腦內(nèi)synapsinⅠ磷酸化的影響
　　20只雄性BALB/c小鼠隨機(jī)分為對(duì)照組和七氟醚麻醉30min組，每組10只。對(duì)照組直接脫臼處死。七氟醚

16、麻醉組小鼠吸入1MAC七氟醚30min后脫臼處死。動(dòng)物處死后每組取4只作皮質(zhì)和海馬磷酸化synapsinⅠ（pSYNⅠ）的westernblotting分析，另6只灌注取腦，作大腦皮質(zhì)部位pSYNⅠ的免疫組織化學(xué)分析。
　　免疫組化結(jié)果顯示：與對(duì)照組相比，七氟醚麻醉后小鼠大腦皮質(zhì)區(qū)域pSYNⅠ陽(yáng)性神經(jīng)纖維表達(dá)量降低，具有顯著性差異（P<0.01），Westernblotting結(jié)果表明七氟醚麻醉小鼠感覺運(yùn)動(dòng)皮質(zhì)pSYNⅠ/Acti

17、n的光密度比值與對(duì)照組相比也有下降的趨勢(shì)，但無(wú)顯著性差異（P>0.05）。
　　結(jié)論：
　　1.異丙酚、氯胺酮與七氟醚麻醉下小鼠腦內(nèi)pERK1/2陽(yáng)性細(xì)胞變化部位大致相似。ERK磷酸化發(fā)生抑制的部位主要為海馬和廣泛的皮質(zhì)區(qū)域包括感覺運(yùn)動(dòng)皮質(zhì)、梨狀皮質(zhì)、扣帶皮質(zhì)和嗅周皮質(zhì)等，可能與麻醉引起記憶與感覺認(rèn)知缺失有關(guān)。而ERK磷酸化增強(qiáng)的主要是皮質(zhì)下核團(tuán)如杏仁中央核、下丘腦室旁核、視上核和EW核等。但不同全麻藥引起皮質(zhì)下pERK1/

18、2增強(qiáng)的部位不盡相同，特別是下丘腦腹內(nèi)側(cè)核的腹外側(cè)部只在異丙酚、氯胺酮靜脈麻醉時(shí)被激活。這些核團(tuán)在全身麻醉中具體起什么作用值得進(jìn)一步研究。
　　2.在對(duì)照和異丙酚麻醉的小鼠腦片上，極少發(fā)現(xiàn)pERK1/2和GAD67雙重標(biāo)記神經(jīng)元。因此認(rèn)為全麻下pERK1/2表達(dá)增強(qiáng)或者減弱的神經(jīng)元并不是直接激活GABA能神經(jīng)元。
　　3.在異丙酚、氯胺酮和七氟醚麻醉小鼠中腦EW核內(nèi)存在大量的pERK1/2和urocortin雙標(biāo)陽(yáng)性神經(jīng)元。

19、表明全麻時(shí)EW核pERK1/2表達(dá)增強(qiáng)與應(yīng)激反應(yīng)調(diào)節(jié)有關(guān)。
　　4.毀損SD大鼠的杏仁中央核或EW核后，異丙酚、氯胺酮和七氟醚麻醉大鼠的翻正反射消失時(shí)間和翻正反射恢復(fù)時(shí)間并沒(méi)有發(fā)生顯著的改變，說(shuō)明這兩個(gè)部位在全麻意識(shí)消失的產(chǎn)生機(jī)制中不起關(guān)鍵作用。
　　5.使用PKC抑制劑白屈菜紅堿后，七氟醚麻醉小鼠翻正反射消失時(shí)間縮短，夾尾反射恢復(fù)時(shí)間延長(zhǎng)，并且在一定范圍內(nèi)隨劑量增大效應(yīng)更加明顯。提示在整體動(dòng)物上抑制PKC活性可以增強(qiáng)全麻效