MicroRNA在心臟重塑、逆重塑過程中的變化及可能作用機制的研究.pdf

1、研究背景： 在現(xiàn)代工業(yè)社會中，心功能不全、心衰已經(jīng)成為病人住院和死亡的主要因素，其臨床表現(xiàn)主要為心臟的擴大和重塑。心肌梗死，高血壓，主動脈狹窄，瓣膜病變等心臟疾病都會造成血液動力學及神經(jīng)內(nèi)分泌的變化，而這些變化往往會引起心肌細胞內(nèi)分子通路或轉(zhuǎn)移通路的病理性變化，在壓力負荷的作用下心臟往往表現(xiàn)為肥大，心肌重塑等改變。而當今左心輔助已經(jīng)被用來作為心功能不全病人心臟移植前的過渡治療，起一定的橋梁作用，或作為改善心肌功能儲備，來改善心衰

2、患者愈后的有力手段。并且在EmmaJ等人的一些試驗中發(fā)現(xiàn)對于一些非心梗病人，左心輔助結合藥物治療能顯著改善患者愈后，在輔助一段時間后，撤離左心輔助，這些病人的心功能較前有明顯改善，生活能力有顯著好轉(zhuǎn)。左心輔助已成為心功能不全的有效治療手段，其對于心肌的重塑，心肌微結構的恢復及相關基因和蛋白成分的逆轉(zhuǎn)均有作用。 MicroRNAs(miRNAs)是一種大小約21-23個堿基，它能通過對mRNA的表達進行抑制從而對基因的表達進行調(diào)控

3、，在腫瘤，病毒，細胞增殖，凋亡等各個方面起作用。現(xiàn)在大量的研究表明，miRNA與心臟疾病有著密切的相關性，2005年DRZhao首先發(fā)現(xiàn)miRNA-1-2被特定性在心臟中存在并通過Hand2通道起作用，圍繞miRNA的心臟作用的研究由此展開。迄今為止已發(fā)現(xiàn)miRNA在心肌肥大，心肌梗死后心律失常中起作用，并參與心肌的凋亡，其中miR-1，195，212，208，133等已經(jīng)被證實通過不同的分子通路在上述的各個方面起作用。但關于miRNA

4、和心肌逆重塑相關性方面的相關研究未見報道，通過我們的研究我們希望找到其中的相關性。大鼠異位心臟移植現(xiàn)在作為研究左心卸負荷對于正常心臟，肥大及心衰心臟的造成的基因或分子生物學改變的一個廣泛運用的工具。本研究將試圖通過同源腹腔異位移植肥大心臟來創(chuàng)建大白鼠心衰后機械減負模型來模擬臨床使用LVAD患者，尋找miRNA和心肌重塑之間的相關性，為探討LVAD患者臨床康復的機制打下基礎，為探討人類心衰后使用左心輔助裝置的恢復機制提供新的方法。

5、 方法： 健康的近交系Lewis雄性大鼠體重180～200g，采用分組研究的方法，分為實驗對照組，心肌肥厚組，心肌肥厚卸負荷組3組。通過腹主動脈縮窄術制造心肌肥厚模型，術后6周經(jīng)超聲心動圖篩選，以經(jīng)超聲心動圖篩選的肥厚模型作為供體，與同窩的大鼠行腹部異位心臟移植術。肥厚移植組，術后2周行心超檢測，觀察期滿后處死動物取出心臟，取其左室游離壁，稱重并行常規(guī)病理(石蠟切片及HE染色和天狼星紅染色)觀測心肌細胞及蛋白、膠原變化。取各組部

6、分左室游離壁心肌組織TRlzol法提取RNA，用miRNeasy提取miRNA，測其濃度，行miRNA基因芯片檢測，進行統(tǒng)計，觀察3組miRNA變化。取各組組間相差大于2倍的基因為目的基因進行篩選，并查找在各組中均有變化，而且變化倍數(shù)大于2倍的miRNA行實時定量qRT-PCR檢測，以U6為內(nèi)參，染料法驗證各組之間目的miRNA的變化。 結果： 1、復制腹主動脈縮窄模型35例，6周后符合心肌肥厚模型的有25例，成功率為7

7、1％。復制肥厚移植模型15例，成功9例，成功率60％。 2、經(jīng)心肌肥厚模型后的心臟重量較假手術組有明顯增加，心臟重量比大鼠整體重量比也有明顯增加，心肌肥厚經(jīng)卸負荷后大鼠心臟重量及心臟與整體重量比較術前有明顯減少。 3、心臟超聲檢查結果顯示：心肌肥大模型組相對對照組心臟的左室舒張末期左室前壁厚度(LVAWd)；左室舒張末期左室后壁厚度(LVPWd)均有明顯增加(p＜0.05)；而相對與心肌肥大模型組，肥大后卸負荷組的左室舒

8、張末期左室前壁厚度(LVAWd)；左室舒張末期左室后壁厚度(LVPWd)有明顯下降(p＜0.05)：各組左心室舒張末期內(nèi)徑(LVEDD)比較均無明顯差別。 4、HE染色可見心肌肥大模型組心肌橫截面積(CSA)較對照組增加了135％，而肥大后卸負荷組的心肌橫截面積(CSA)較心肌肥大組下降了54％。 5、心肌膠原經(jīng)天狼星紅染色檢測其變化，膠原呈紅色，細胞核呈綠色，其它成分呈黃色，在心肌肥大組，心肌肥大卸負荷組中膠原表達較對

9、照組均有明顯增加。 6、將3組心肌游離壁心肌組織提取miRNA行miRNA基因芯片技術檢測各組間miRNA的改變，及相差倍數(shù)。發(fā)現(xiàn)各組中有293個miRNA發(fā)生了改變，其中有40個miRNA發(fā)生2倍以上改變。其中相差大于2倍的在心肌肥大模型組相對于對照組其中有1個miRNA升高，有8個miRNA下降；而肥大后卸負荷組相對于肥大組中有28個miRNA升高，而有10個miRNA下降。 7、我們將各組中有連續(xù)相關性變化的miR

10、NA進行實時定量qRT-PCR檢測，共對6個miRNA進行驗證，結果發(fā)現(xiàn)有4組發(fā)生了顯著性變化。各組間ΔΔCT差大于2倍。 結論： 大鼠心肌肥厚及肥厚卸負荷模型能較好的模擬左心輔助卸負荷過程。在肥厚過程中，心肌組織及細胞均出現(xiàn)了正向改變，而經(jīng)卸負荷后部分逆轉(zhuǎn)，但膠原組織逆轉(zhuǎn)不良。較多miRNA在肥厚及卸負荷過程中發(fā)生了改變，經(jīng)過對部分改變較顯著的miRNA作用靶點的查找發(fā)現(xiàn)，miR-23a、26a、29a、212等可能通