microRNA在心肺復(fù)蘇后心肌損傷病理過程中的作用研究.pdf

1、研究背景：心搏驟停是嚴(yán)重的全身性缺血缺氧性疾病，加上復(fù)蘇過程中所經(jīng)歷的缺血再灌注損傷，使得復(fù)蘇成功率低下，長期以來都是急診醫(yī)學(xué)的研究熱點(diǎn)，有諸多問題亟待解決。復(fù)蘇后伴隨復(fù)蘇后心、腦、腎等重要器官損傷的病理生理變化，其中心搏驟停復(fù)蘇后的心肌功能障礙是院內(nèi)外心搏驟?；颊咦灾餮h(huán)恢復(fù)后早期死亡的重要原因之一。microRNA(miRNA)是新近發(fā)現(xiàn)的一類非蛋白編碼的單鏈RNA分子，部分miRNA在心肌中特異性表達(dá)，并在心肌缺血和再灌注損傷可能

2、發(fā)揮重要作用，抑制/過表達(dá)此類miRNA可減輕/加重心肌缺血再灌注損傷。研究同時發(fā)現(xiàn)，miRNA與心肌細(xì)胞凋亡關(guān)系密切，miRNA-1和miRNA-133是心肌細(xì)胞凋亡研究的熱點(diǎn)。但心肺復(fù)蘇后miRNA的變化和作用目前尚少有研究。因此，本研究觀察窒息型心肺復(fù)蘇大鼠心肌miRNA的變化，探討miRNA在心肺復(fù)蘇后心肌損傷病理過程中所起的作用。
　　本課題共分成兩部分:
　　第一章講述心肺復(fù)蘇后大鼠心肌損傷相關(guān)的microRNA

3、表達(dá)變化;
　　第二章講述凋亡相關(guān)性microRNA及其靶基因蛋白在心肺復(fù)蘇后大鼠心肌損傷病理過程中的作用。
　　第一章 心肺復(fù)蘇后大鼠心肌損傷相關(guān)microRNA表達(dá)變化
　　目的:探討窒息型大鼠心搏驟停-心肺復(fù)蘇(CA-CPR)后心肌微小RNA（miRNA）表達(dá)的動態(tài)變化，尋找心肺復(fù)蘇后心肌損傷可能的機(jī)制及相關(guān)的miRNA。
　　方法:成年雄性SD大鼠64只，體重250～330 g，采用隨機(jī)數(shù)表法將其分為2組

4、(n=32)，對照組（A組）和CA-CPR組（B組）。采用窒息法建立CA-CPR模型。于自主循環(huán)恢復(fù)(ROSC)（B組）和氣管切開插管（A組）后3h、6h、12h和24 h時，隨機(jī)取8只大鼠采血備用并取心肌組織待測，用Real-Time PCR法檢測心肌組織miRNA。以相對于A組心肌miRNA2倍強(qiáng)度的變化作為B組miRNA表達(dá)升高或降低的標(biāo)準(zhǔn)。以相對于A組5倍強(qiáng)度的變化作為B組miRNA表達(dá)明顯變化的標(biāo)準(zhǔn)。
　　結(jié)果:與A組同

5、時點(diǎn)比較，復(fù)蘇組大鼠在ROSC后3h心肌有9個miRNA表達(dá)上調(diào)，20個miRNA表達(dá)下調(diào);ROSC后6h心肌組織有4個miRNA表達(dá)上調(diào)，40個miRNA表達(dá)下調(diào);ROSC后12 h心肌組織有10個miRNA表達(dá)上調(diào)，32個miRNA表達(dá)下調(diào);ROSC后24 h心肌組織有26個miRNA表達(dá)上調(diào)，11個miRNA表達(dá)下調(diào)，且不同的miRNA在不同時點(diǎn)存在動態(tài)變化，ROSC后持續(xù)性變化的miRNA有8個，分別為miRNA-1、miRNA

6、-21、miRNA126、miRNA-133a、miRNA-206、miRNA-210、miRNA-320及miRNA-499。 miRNA-1各時點(diǎn)表達(dá)均上調(diào)，ROSC后6h時最高;miRNA-21各時點(diǎn)表達(dá)均下調(diào)，ROSC后6h時最低;miRNA-126、miRNA-133a、miRNA-206、miRNA-210和miRNA-499ROSC后3h、6h時表達(dá)下調(diào)，ROSC后12h、24 h時表達(dá)上調(diào)，ROSC后6h時最低;miRN

7、A-320 ROSC后3 h～12 h時表達(dá)上調(diào)，ROSC后24 h時表達(dá)下調(diào)，ROSC后6h時最高(P＜0.05或0.01)。
　　結(jié)論:大鼠CPR后早期即存在多個心肌損傷相關(guān)miRNA的表達(dá)變化，其中有8個miRNA存在明顯動態(tài)變化，可能成為心肺復(fù)蘇后心肌保護(hù)的新靶點(diǎn)。
　　第二章 凋亡相關(guān)性microRNA及其靶基因蛋白在心肺復(fù)蘇后大鼠心肌損傷病理過程中的作用
　　目的:選擇心肺復(fù)蘇后表達(dá)明顯變化且與凋亡相關(guān)的m

8、iRNA-1及miRNA-133a，測定其靶基因蛋白Bcl-2、Bax的變化，同時觀察心肌細(xì)胞凋亡指數(shù)、凋亡率以及心肌組織病理學(xué)改變，探討miRNA在CPR后大鼠心肌損傷的作用及其可能的機(jī)制。
　　方法:利用生物信息學(xué)方法，對第一部分研究中明顯變化的8個miRNA的靶基因進(jìn)行了預(yù)測，結(jié)合相應(yīng)的文獻(xiàn)資料，確定和凋亡明顯相關(guān)且在心肺復(fù)蘇后變化明顯的miRNA為miRNA-1及miRNA-133a，對應(yīng)為Bcl-2、Bax基因。該兩個m

9、iRNA在ROSC24 h變化仍明顯。故取A組和B組24 h時點(diǎn)的待測血液和心肌組織，免疫抑制法測定血清CK-MB濃度，化學(xué)發(fā)光法測定血清cTnⅠ濃度，以脫氧核糖核昔酸末端轉(zhuǎn)移酶介導(dǎo)的缺口末端標(biāo)記（TUNEL）法檢測自主循環(huán)恢復(fù)后(ROSC)后24 h的心肌細(xì)胞凋亡指數(shù)(AI)，以熒光素標(biāo)記的膜聯(lián)蛋白Ⅴ聯(lián)合PI染色（Annexin-Ⅴ/PI）雙參數(shù)技術(shù)用流式細(xì)胞儀定量檢測心肌細(xì)胞凋亡率，以免疫組化法檢測凋亡蛋白Bcl-2，Bax表達(dá)，光

10、鏡及電鏡下觀察24 h時點(diǎn)心肌細(xì)胞病理改變。統(tǒng)計(jì)分析miRNA-1、miRNA-133a和Bcl-2、Bax蛋白的相關(guān)性。
　　結(jié)果:與A組比較，B組ROSC后24 h凋亡指數(shù)、凋亡率、血清CK-MB和cTnⅠ含量、Bcl-及Bax蛋白和miRNA-1、miRNA-133a表達(dá)均顯著增高(P＜0.01)。光鏡和透射電鏡下B組大鼠心肌均發(fā)現(xiàn)顯著的病理變化。miRNA-1、miRNA-133a分別和Bcl-2、Bax的變化具有顯著相關(guān)