腦紅蛋白及熱休克蛋白60在腦挫裂傷病理過程中的作用研究.pdf

1、研究背景腦挫裂傷是常見的神經(jīng)外科疾病，是當(dāng)今威脅人類生命的主要疾病之一。在醫(yī)學(xué)不斷進步的今天，腦挫裂傷的致殘、致死率卻一直居高不下，至今仍沒有一項十分有效的治療方法。因此，從腦挫裂傷發(fā)病機制出發(fā)，研究其致病因子對于臨床實踐十分重要。
　　 腦紅蛋白(Neuroglobin，Ngb)是新近發(fā)現(xiàn)的一種主要位于神經(jīng)元內(nèi)、能夠可逆性結(jié)合氧的球蛋白，它是一個新的內(nèi)源性神經(jīng)保護因子。目前研究表明，Ngb對腦缺血缺氧具有保護作用。熱休克蛋白6

2、0(Heat Shock Protein60，HSP60)主要定位于細胞線粒體內(nèi)，生理狀態(tài)下，HSP60協(xié)助細胞多肽或蛋白質(zhì)正確轉(zhuǎn)位、折疊和裝配，當(dāng)受到不良刺激時，HSP60的表達明顯增加，維持細胞內(nèi)必需蛋白質(zhì)的空間構(gòu)象，從而保護細胞生命活動，確保細胞生存。為了探究Ngb及HSP60在腦挫裂傷的病理過程中所起的作用，我們做了一些研究。
　　 本課題共分為三個部分:
　　 第一章腦挫裂傷患者腦組織及血中白細胞差異蛋白質(zhì)組的

3、表達;
　　 第二章Ngb及HSP60在腦挫裂傷患者腦組織中的表達;
　　 第三章Ngb及HSP60在腦挫裂傷患者血清中的表達。
　　 第一章腦挫裂傷患者腦組織及血中白細胞差異蛋白質(zhì)組的表達
　　 目的:通過雙向凝膠電泳技術(shù)建立腦挫裂傷組和正常對照組分辨率高、重復(fù)性好的腦組織及血中白細胞蛋白質(zhì)表達圖譜，尋找差異表達的蛋白質(zhì)點，探討其功能和作用。
　　 方法:分別采集10例腦挫裂傷患者和10例正常腦

4、組織及血液標(biāo)本，應(yīng)用淋巴細胞分離液分離白細胞，再運用二維凝膠電泳技術(shù)提取腦組織及白細胞的蛋白質(zhì)，用PDquest圖像分析軟件識別差異蛋白質(zhì)點，MADLI-TOF和生物信息學(xué)技術(shù)對其進行鑒定和分析。
　　 結(jié)果:通過PDQuest7.0分析軟件進行點檢測，分別獲得腦組織及白細胞的蛋白質(zhì)點數(shù)，在腦組織部分:正常組為(764±28)個，腦挫裂傷組(753±19)個。通過和正常對照組進行比較，可發(fā)現(xiàn):腦挫裂傷組中表達上調(diào)的蛋白質(zhì)點有15

5、個，表達下調(diào)的蛋白質(zhì)點有16個。經(jīng)過與蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫比較及質(zhì)譜技術(shù)分析，取9個差異蛋白點進行了鑒定。結(jié)果顯示，在9個蛋白質(zhì)點中有7個蛋白質(zhì)點得到鑒定，它們?yōu)榱蜓踹€蛋白(Thioredoxin，Trx)，泛素羥基端水解酶L1(Ubiquitincarboxy-terminal hydrolase isozyme L1， UCH-L1)，腦紅蛋白(Neuroglobin，Ngb)，NSFL1輔助因子p47(NSFL1 cofactor p47

6、)，微管蛋白α鏈(Microtubulin alpha chain)，二氫嘧啶酶相關(guān)蛋白2(Dihydropyrimidinase-related protein2)，突觸小體膜聯(lián)合25K蛋白（Synaptosomal associated25K protein）。在白細胞部分:正常組為(572±18)個，腦挫裂傷組(518±16)個。與正常組比較分析，腦挫裂傷組中表達上調(diào)的蛋白質(zhì)點有21個，表達下調(diào)的蛋白質(zhì)點有17個。經(jīng)過與蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)

7、庫比較及質(zhì)譜技術(shù)分析，取9個差異蛋白點進行了鑒定。結(jié)果顯示，在9個蛋白質(zhì)點中有6個蛋白質(zhì)點得到鑒定，它們?yōu)殁}網(wǎng)織蛋白前體(Calreticulin precursor)、熱休克蛋白60(Heat ShockProtein60，HSP60)、鈣依賴性蛋白激酶(Calcium-dependent proteinkinase)、脂酰輔酶A脫氫酶(Fatty acyl-coa dehydrogenase)、谷氨酸脫氫酶前體（Glutamate

8、dehydrogenase precursor）和醛脫氫酶(Aldehyde dehydrogenase)。
　　 結(jié)論:1、通過雙向凝膠電泳技術(shù)初步建立了腦挫裂傷組及正常對照組腦組織及白細胞蛋白質(zhì)組表達圖譜;
　　 2、經(jīng)過凝膠圖像分析，腦挫裂傷組及正常對照組腦組織及白細胞二維凝膠電泳圖譜的表達具有明顯差異;
　　 3、經(jīng)過與蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫比較及質(zhì)譜技術(shù)分析，鑒定出的差異蛋白質(zhì)有可能通過細胞分裂、細胞信號傳導(dǎo)、蛋

9、白質(zhì)降解通路、氧化還原反應(yīng)等參與腦挫裂傷的病理過程，其中Ngb及HSP60在腦挫裂傷的病理過程可能起著重要作用。
　　 第二章腦紅蛋白及熱休克蛋白60在腦挫裂傷患者腦組織中的表達
　　 目的:應(yīng)用免疫組織化學(xué)方法檢測腦挫裂傷患者組及正常對照組腦組織中Ngb及Hsp60的表達，研究Ngb及Hsp60在腦挫裂傷患者組及正常對照組的表達差異，評價Ngb及Hsp60在腦挫裂傷的病理過程的作用。
　　 方法:采用SP法，按

10、照北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司提供的SP試劑盒說明書進行。本研究切取10例成年腦挫裂傷患者（受傷部位均為右額葉）額葉皮層組織標(biāo)本，以10例成年腦室腫瘤患者行腫瘤切除術(shù)取得的正常額葉皮層組織標(biāo)本為正常對照。然后按照SP試劑盒說明書進行切片、脫蠟及水化、漂洗及蒸餾水洗滌、微波修復(fù)、加入一、二抗孵育、光鏡下觀察、蘇木素襯染、樹膠封片、光鏡下觀察切片染色情況并拍照。
　　 結(jié)果:1.免疫組化檢測結(jié)果顯示Ngb表達定位于胞漿內(nèi)，胞漿內(nèi)淺棕

11、色物質(zhì)即為Ngb檢測陽性。在正常腦組織中Ngb呈弱陽性表達，腦挫裂傷灶腦組織呈陽性表達;而挫裂傷灶周圍接近正常的腦組織中Ngb表達呈強陽性，與正常對照組比較有顯著性統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。
　　 2.免疫組化檢測結(jié)果顯示HSP60表達定位于胞漿內(nèi)，胞漿內(nèi)淺棕色物質(zhì)即為HSP60檢測陽性。在正常腦組織中HSP60呈陽性表達，在腦挫裂傷灶腦組織呈陽性表達，而腦挫裂傷灶周圍接近正常的腦組織中HSP60表達呈強陽性，與正常對照組比較

12、有顯著性統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。
　　 結(jié)論:腦挫裂傷灶周圍接近正常的腦組織Ngb及HSP60表達呈強陽性，提示Ngb及HSP60在腦挫裂傷病理過程中發(fā)揮了重要作用。
　　 第三章腦紅蛋白及熱休克蛋白60在腦挫裂傷患者血清中的表達
　　 目的:應(yīng)用免疫印跡方法檢測腦挫裂傷患者組及正常對照組血清中Ngb及HSP60的表達，研究Ngb及HSP60在腦挫裂傷患者組及正常對照組血清中的表達差異，評價Ngb及HSP60

13、在腦挫裂傷的病理過程的作用。
　　 方法:參照《現(xiàn)代細胞分子生物學(xué)技術(shù)》操作。10例腦挫裂傷患者血清均為腦外傷后未經(jīng)手術(shù)治療患者的血清，正常人血清由年齡和性別匹配的10例志愿者提供。血清樣本稀釋10倍后，測定蛋白質(zhì)的濃度，再進行聚丙烯酰胺凝膠電泳，電轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，以一抗、二抗孵育，用ECL試劑發(fā)光及顯影，并以膠中非目的蛋白質(zhì)條帶作為上樣量對照。再經(jīng)掃描獲取圖像，用圖像分析軟件確定其灰度值，分析特異蛋白的表達水平。
　

14、　 結(jié)果:1.在正常人血清中Ngb呈低表達;腦挫裂傷后3小時血清中Ngb表達升高，在12小時后Ngb達到峰值，其后表達逐漸下降，72小時后Ngb表達恢復(fù)至正常。腦挫裂傷后6h及12h Ngb表達與對照組比較有顯著性統(tǒng)計學(xué)差異(P＜0.05).
　　 2.在正常人血清中HSP60呈低表達;腦挫裂傷后3小時血清中HSP60表達升高，直到72小時后才到峰值。腦挫裂傷后24h、48h及72h HSP60表達與對照組比較有顯著性統(tǒng)計學(xué)差

15、異(P＜0.05)。結(jié)論:本章實驗結(jié)果顯示，經(jīng)免疫印跡檢測腦挫裂傷患者血清中Ngb及HSP60的表達增強，與正常對照組比較差異有顯著統(tǒng)計學(xué)意義，提示Ngb及HSP60在腦挫裂傷病理過程中發(fā)揮了重要作用。
　　 綜上所述，本研究結(jié)論如下:
　　 本系列研究通過蛋白質(zhì)組學(xué)及免疫組化、免疫印跡手段研究腦挫裂傷后人腦組織及血清中蛋白質(zhì)表達，得出如下結(jié)論:
　　 通過蛋白質(zhì)組學(xué)和免疫組化、免疫印跡方法的研究，證明了Ngb和