胞紅蛋白在藏羚羊腦組織的基因和蛋白表達(dá)的研究.pdf

1、藏羚羊常年生活在青藏高原海拔4500m以上的高寒缺氧地區(qū),需要時(shí)卻能夠以60km/h連續(xù)奔跑70-100km,具有對(duì)高原低氧環(huán)境非常好的適應(yīng)能力和極強(qiáng)的耐缺氧能力。根據(jù)國(guó)內(nèi)外的研究顯示：藏羚羊低氧性肺血管收縮反應(yīng)鈍化，肺動(dòng)脈壓不高，右心室無(wú)肥大；氧解離曲線左移；紅細(xì)胞數(shù)、紅細(xì)胞壓積和血紅蛋白含量在高原低氧環(huán)境下沒(méi)有出現(xiàn)明顯的異常改變，同時(shí)在低氧環(huán)境中藏羚羊還能保持較高的血氧飽和度。因此我們認(rèn)為，藏羚羊是研究高原低氧適應(yīng)的最佳動(dòng)物模型。<

2、br>　　胞紅蛋白(cytoglobin,CGB)是于2002年被發(fā)現(xiàn)的攜氧球蛋白。CGB基因序列與血紅蛋白(hemoglobin,HGB)、肌紅蛋白(myoglobin,MGB)及腦紅蛋白(neuroglobin,NGB)有明顯的序列同源性。CGB與HGB、MGB和NGB共同組成了攜氧球蛋白家族。CGB廣泛分布于多種組織和器官中，在結(jié)締組織的細(xì)胞中CGB分布于細(xì)胞質(zhì)，而在神經(jīng)組織的細(xì)胞中CGB分布于細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)。CGB呈典型的三明治

3、夾心型螺旋球蛋白折疊結(jié)構(gòu)，CGB在生理?xiàng)l件下含有6個(gè)配位鍵,不同于HGB和MGB的5個(gè)配位鍵結(jié)構(gòu)。根據(jù)目前的研究報(bào)道，CGB具有以下功能：攜氧、儲(chǔ)氧、氧感受器、具有過(guò)氧化物酶和過(guò)氧化氫酶活性、細(xì)胞保護(hù)、促膠原形成和抗腫瘤等功能。CGB的組織細(xì)胞分布、分子結(jié)構(gòu)和生物學(xué)功能及機(jī)制還需要更多的時(shí)間和投入來(lái)研究。CGB的發(fā)現(xiàn)及對(duì)其的深入研究將極大的豐富機(jī)體氧運(yùn)輸、氧代謝和氧利用的研究。
　　在高原高海拔環(huán)境下，藏羚羊大腦這樣一個(gè)高耗氧量的

4、器官,在高原低氧的條件下,腦組織應(yīng)該有更加有效的方式最大程度地?cái)z取和利用有限的氧,完成正常的生理功能。我們關(guān)注到CGB與氧的高親和力、相對(duì)低的解離率并不支持經(jīng)典攜氧球蛋白的攜氧功能，CGB只是作為一個(gè)暫時(shí)的氧貯存器起貯氧作用，在缺氧的情況下持續(xù)地、小量地為組織細(xì)胞供氧和促進(jìn)氧在線粒體中擴(kuò)散。因此我們有理由相信CGB在藏羚羊腦組織表達(dá)的研究，對(duì)于進(jìn)一步探討研究藏羚羊高原低氧的適應(yīng)性問(wèn)題具有重要的意義。
　　目的：旨在克隆藏羚羊CGB

5、基因編碼區(qū)，檢測(cè)CGB在成年藏羚羊不同腦區(qū)腦組織中的mRNA和蛋白表達(dá)，同時(shí)探討藏羚羊低氧適應(yīng)的分子生物學(xué)機(jī)制。
　　方法：（1）藏羚羊腦組織取材。（2）TRIzol試劑一步抽提法提取藏羚羊腦組織總RNA，以其中的mRNA作為模板，采用Oligo(dT)或隨機(jī)引物利用逆轉(zhuǎn)錄酶反轉(zhuǎn)錄成cDNA，再以cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，從而獲得目的基因。（3）實(shí)時(shí)定量基因擴(kuò)增熒光檢測(cè)系統(tǒng)，采用SYBR熒光染料，進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR反

6、應(yīng)，檢測(cè)CGB在藏羚羊不同腦區(qū)腦組織中的mRNA表達(dá)。（4）蛋白免疫印記（Westernblot）檢測(cè)CGB在藏羚羊不同腦區(qū)腦組織的蛋白表達(dá)。（5）SPSS16.0統(tǒng)計(jì)分析軟件統(tǒng)計(jì)分析：數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示,組間比較采用方差分析，以α=0.05，為檢驗(yàn)水準(zhǔn)，P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　結(jié)果：（1）將含有目的片段陽(yáng)性克隆經(jīng)測(cè)序和Blast分析，顯示其部分編碼序列與GenBank中綿羊、大鼠等同源性很高（大于90％），表