藏羚羊與普氏原羚異種克隆胚胎發(fā)育的轉錄組學研究.pdf

1、藏羚羊和普氏原羚，屬偶蹄目?？圃鐚伲饕植荚谖覈嗖馗咴那嗪?、西藏和新疆，是世界上最瀕危物種。體細胞重編技術給保護瀕危物種，提供了另一種潛在的途徑。體細胞重編程技術主要包括:體細胞核移植技術和誘導多能干細胞技術。但是，親緣關系較遠的物種異種克隆生產后代比較困難，這可能會歸因于一些發(fā)育相關的機制的原因。本研究當中供體細胞是已經處于分化末端的藏羚羊和普氏原羚體細胞，在以牛卵母細胞作為受體胞質，構建藏羚羊-牛異種克隆重構胚(ZBNT)和

2、普氏原羚-牛異種克隆重構胚(PBNT)，研究發(fā)現(xiàn)在異種克隆胚胎中早期的發(fā)育的8-16細胞時期會產生發(fā)育阻滯，囊胚的發(fā)育率在1.5％之下。我們首先從胚胎發(fā)育的阻滯期做了轉錄組學的分析，試圖找出異種克隆胚胎發(fā)育阻滯的原因。同時采用了體細胞重編程技術手段-誘導干細胞多能性技術，對藏羚羊體細胞在體外進行了多能性誘導，之后再應用到異種克隆胚胎研究當中，旨在從另外一種渠道來提高異種克隆胚胎發(fā)育效率。
　　1、我們首先以普氏原羚的成體細胞作為核

3、供體，以牛的卵母細胞作為受體胞質，進行異種克隆操作，并且對牛同種和普氏原羚-牛異種克隆胚胎進行了轉錄組基因芯片分析。分析結果顯示:牛-牛同種克隆胚胎基因表達與重編程相關的基因要顯著高于異種克隆胚胎(1527∶643)。在異種克隆胚胎中，總共有139個與轉錄調控相關轉錄調控因子(TFs)沒有被激活。在同種克隆胚胎中，母源性降解相關的基因有1515個基因表達下調，而在普氏原羚-牛異種克隆胚胎當中，只有343基因下調。線粒體與核DNA互作相關

4、的基因，特別是TOMM/TIMM復合物基因，在同種克隆當中有很高的表達，而在異種克隆胚胎中表達量很低。綜上所述，在PBNT的異種克隆胚胎中，母源基因的不恰當?shù)慕到?，轉錄因子的不完全激活、線粒體相關功能的基因的不正常表達可能導致細胞在異種胞質當中的重編程失敗，導致異種克隆胚胎發(fā)育異常。
　　2、在以上研究的基礎上，對藏羚羊的成體細胞作為核供體，以牛的卵母細胞作為受體胞質，進行異種克隆操作，并且研究了藏羚羊異種克隆胚胎的發(fā)育，并且以普

5、氏原羚-牛、牛-牛重構胚作為對照，研究發(fā)現(xiàn)，藏羚羊-牛胚胎囊胚發(fā)育率為0.8％，與普氏原羚異種克隆胚胎發(fā)育率相近(1.07％)，顯著的低于牛同種克隆胚胎的發(fā)育(22.9％)。我們又重新設計并且重新引入了藏羚羊-牛的異種克隆胚胎(ZBNT)，試圖在異種克隆胚胎(ZBNT、PBNT)與同種克隆胚胎(BBNT)找出，在異種克隆胚胎發(fā)育中的共性。進而更進一步的揭示異種克隆胚胎發(fā)育阻滯的原因。對牛同種和普氏原羚-牛異種克隆胚胎、藏羚羊-牛異種克隆

6、胚胎進行了更為全面系統(tǒng)的轉錄組基因芯片分析。結果顯示:在與同種克隆胚胎相比之后，有411個基因是在異種克隆胚胎當中所特有的表達下調基因，這些基因的GO分析集中在了細胞的膜系統(tǒng)功能區(qū)域，包括:nuclear lumen，intracellular organelle lumen, membrane-enclosed lumen,organelle lumen等功能區(qū)域;還有核糖體發(fā)生區(qū)域，包括:ribonucleoprotein comp

7、lex biogenesis, ribosome biogenesis等功能區(qū)域。之后我們分析了TOMM/TIMM復合物基因家族，發(fā)現(xiàn)在異種胚胎當中（包括藏羚羊-牛異種克隆胚胎、普氏原羚-牛異種克隆胚胎）表達整體下調，與之前所得出結論完全相符。之后我們也發(fā)現(xiàn)在異種克隆共同表達下調的基因當中，轉錄輔激活因子mediator復合物家族成員中一部分基因是非常明顯的，其中mediator家族是轉錄起始的一個重要的結構蛋白，MED家族在異種克隆胚

8、胎中整體表達趨勢下調。此外，有關核糖體發(fā)生功能區(qū)域的基因家族，包括:ribosomal protein large subunit(RPL家族)和ribosomal protein small subunit（RPS家族），這兩個家族的基因是編碼核糖體大小亞基的基因家族，在異種克隆胚胎(ZBNT和PBNT)當中，有關核糖體合成相關的大小亞基表達普遍低于同種克隆胚胎(BBNT)。同樣，與同種克隆胚胎相比之后，有729個基因在異種克隆胚胎中

9、表達上調，通過GO分析之后，這些基因的主要功能集中在了nucleotide binding，purine nucleotide binding, ribonucleotide binding, purineribonucleotide binding等相關的通路。在這些通路中HSP(HeatShock Protein)家族基因在異種克隆胚胎中表達明顯高于在同種克隆胚胎中的表達。綜上所述，在ZBNT和PBNT的異種克隆胚胎中，不光是線粒體

10、結構相關基因TOMM/TIMM（復合物基因家族表達出現(xiàn)了異常，而且在轉錄起始的作用原件MED基因家族以及胞質核糖體大小亞基發(fā)生相關基因，也會表達異常。這些基因的表達異常，也可能是導致異種克隆胚胎發(fā)育異常的，導致重編程過程失敗的重要原因。另外在ZBNT和PBNT的異種克隆胚胎中，HSP(Heat Shock Protein)家族基因表達會有明顯的上調，其中也包括了HSP70，HSP90的重要亞基，HSP基因家族在細胞當中扮演重要角色，對于

11、細胞當中物質運輸以及蛋白降解等機制具有重要作用。那么在異種克隆胚胎發(fā)育過程中，可能是在異種克隆胚胎發(fā)育當中，存在一定的應激機制，來促使胚胎當中的HSP的表達。綜上所述，關于異種克隆胚胎當中的這些表達異常，都有可能會是異種克隆胚胎發(fā)育低下的重要原因。
　　3、此外，我們采用了誘導干細胞多能性技術，對藏羚羊體細胞在體外進行了多能性誘導，之后再應用到異種克隆胚胎研究當中，旨在從另外一種渠道來提高異種克隆胚胎發(fā)育效率。本研究利用小鼠(Mu

12、s musculus)來源的Oct-4(又稱POU Class5Homeobox1，簡稱:POU5F1)、Sox-2(Sex Determining Region Y-Box2)、Klf-4(Kruppel-Like Factor4)和c-Myc(V-Myc AvianMyelocytomatosis Viral Oncogene Homolog)等4種重編程因子，對藏羚羊體細胞進行誘導重編程，并將誘導后的細胞作為移植入牛去核的卵母細胞

13、中，進行異種克隆操作，觀察異種克隆胚的體外發(fā)育情況。結果表明，經過4因子誘導之后的藏羚羊細胞并沒有形成ES（embryonic stem cell，簡稱ES細胞）樣細胞克隆，但誘導之后的細胞增殖能力和形態(tài)都發(fā)生了改變。細胞周期分析發(fā)現(xiàn)，誘導后的藏羚羊細胞（簡稱iPS-ZLY細胞）進入G2-M期的比率高于藏羚羊成纖維細胞(21.5％ vs16.7％)。iPS-ZLY細胞在培養(yǎng)的第4天進入生長的平臺期，而ZLY細胞則在第6天進入平臺期。核型

14、分析發(fā)現(xiàn)，iPS-ZLY的正常2n核型比例與ZLY細胞相似(68.3％ vs69.6％)。iPS-ZLY細胞表達OCT-4基因。當把iPS-ZLY細胞移植入去核的牛卵母細胞后，iPS-ZLY異種克隆桑葚胚和囊胚形成率分別為8.5％和2.4％，而ZLY異種克隆胚胎桑葚胚和囊胚形成率則分別為3.8％和0.95％。以上研究表明，經過4種因子誘導之后藏羚羊體細胞，其增殖能力發(fā)生顯著改變，細胞生長周期加快，表達多能基因Oct-4;誘導細胞的異種克

15、隆胚胎發(fā)育率顯著高于普通細胞，誘導細胞對于異種克隆胚胎發(fā)育有促進作用。本研究首次利用重編程因子誘導藏羚羊體細胞，進而對誘導之后的細胞進行了包括細胞周期、染色體核型以及多能性基因的檢測，雖然沒有形成干細胞樣細胞克隆形態(tài)，但是多能性基因Oct-4開始表達，是一個處于分化的體細胞和多能性細胞的種間狀態(tài)，這樣的種間狀態(tài)有助于異種克隆胚胎的發(fā)育。本研究從體外誘導重編程結合異種克隆重編程對藏羚羊分化的體細胞進行試驗研究，在研究重編程機理以及物種保護

16、具有指導意義。
　　綜上所述，體細胞重編程技術主要包括:體細胞核移植技術和誘導多能干細胞技術。親緣關系較遠的物種通過異種克隆生產后代比較困難，這可能會歸因于一些發(fā)育相關機制的原因。體細胞重編技術為保護瀕危物種，提供了另一種潛在的途徑。本文對藏羚羊和普氏原羚進行了異種核移植試驗，研究發(fā)現(xiàn)在異種克隆胚胎發(fā)育過程中會形成發(fā)育阻滯的現(xiàn)象，之后研究針對于異種克隆發(fā)育過程阻滯機理以及如何提高異種克隆胚胎發(fā)育效率的問題開展了大量研究。研究的主要

17、結果如下藏羚羊-牛和普氏原羚-牛異種克隆胚胎在發(fā)育過程中，存在發(fā)育阻滯。這可能歸因于在異種克隆胚胎中，轉錄因子的不完全激活、轉錄輔激活因子mediator復合物家族、線粒體相關TOMM/TIMM復合物基因家族、核糖體發(fā)生功能區(qū)域的基因家族，包括:RPL家族和RPS家族的不正常表達可能導致細胞在異種胞質當中的重編程失敗，進而導致異種克隆胚胎發(fā)育異常。另外，異種克隆胚胎中，HSP家族基因表達會有明顯的上調，其中也包括了HSP70，HSP90