藏羚羊ET-1基因編碼區(qū)的克隆與分析.pdf

1、藏羚羊（Pantholops hodgsonii）隸屬青藏高原土生種偶蹄目、?？啤⒉亓鐚?，棲息在海拔4300～5500m，具有極強的運動能力和低氧耐受能力，是研究高原低氧適應(yīng)機制的最好動物模型，該物種是經(jīng)過無數(shù)代的自然選擇而保留下來的青藏高原特有的土生動物并形成了獨特的低氧適應(yīng)機制。內(nèi)皮素（Endothelin,ET）是一種血管內(nèi)皮細(xì)胞分泌的生物活性多肽，具有強烈收縮血管作用，最初是由豬主動脈內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)上清液分離出的一種血管活性肽,其

2、有3種異構(gòu)肽：ET－1、ET－2及ET－3，ET-1mRNA主要在血管內(nèi)皮細(xì)胞表達(dá)，ET-2主要在腎臟表達(dá)較多，ET-3則主要在神經(jīng)細(xì)胞、腎小管上皮細(xì)胞表達(dá)，有一定的組織特異性，其中以ET－１的生理功能和病理學(xué)意義最大；在正常時肺組織中的肺血管內(nèi)皮細(xì)胞、肺泡上皮、和肺臟神經(jīng)內(nèi)分泌細(xì)胞均有ET-1mRNA,可以表達(dá)和合成ET-1；在引起組織缺血、缺氧和血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷的許多心血管疾病中，內(nèi)皮素均參與發(fā)病過程，尤其在缺氧性肺動脈高壓形成機制

3、中發(fā)揮了重要作用,低氧時作用在血管平滑肌細(xì)胞上，增強ET-1所引起的肺動脈收縮。我們前期預(yù)實驗研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)：藏羚羊雖然常年生活在海拔4500m以上的高寒、缺氧地區(qū)，其肺動脈壓卻低于同海拔的藏綿羊，為了進(jìn)一步從基因水平揭示ET-1在藏羚羊在低氧適應(yīng)中的作用機制，我們從藏羚羊肺臟組織中克隆了ET-1基因并測序及序列分析。
　　本課題將對從可可西里自然保護(hù)區(qū)（4300m）捕捉到的10只藏羚羊、10只藏綿羊和從民和縣(1800m)購買的8

4、只低海拔綿羊的體重、心率、血紅蛋白、肺動脈壓力等生理指標(biāo)進(jìn)行測定并作統(tǒng)計學(xué)分析，應(yīng)用ELISA法測定藏羚羊、藏綿羊和低海拔綿羊血清ET-1含量。從藏羚羊肺臟組織中提取總RNA,通過RT-PCR法分段擴增，并將得到的cDNA序列進(jìn)行拼接后獲得藏羚羊ET-1cDNA編碼區(qū)，編碼區(qū)序列長度為609個bp，編碼202個氨基酸。將該基因的編碼區(qū)序列登陸GenBank，獲得注冊號為JQ031153。利用DNAMAN6.0軟件分析顯示：其序列與綿羊、

5、牛、豬、大鼠以及斑馬魚的的同源性分別是：98％、95%、86%、81%、48%；推測出氨基酸序列與綿羊、牛、豬、大鼠以及斑馬魚的的同源性分別是：97%、94%、79%、76%、34%；與NCBI數(shù)據(jù)庫登錄的綿羊ET-1氨基酸比對發(fā)現(xiàn)藏羚羊ET-1基因?qū)?yīng)的氨基酸發(fā)生突變：30位和172位的蘇氨酸變?yōu)楸彼帷?0位和163位的纈氨酸變?yōu)楸彼帷?41位天冬氨酸變?yōu)樘於０贰?81位的苯丙氨酸變?yōu)槔i氨酸，這種突變是否與藏羚羊肺血管低氧適應(yīng)有

6、關(guān)待進(jìn)一步研究。為此本研究克隆了藏羚羊肺組織ET-1基因的CDS區(qū)，并發(fā)現(xiàn)藏羚羊ET-1基因編碼的氨基酸發(fā)生突變，在基因水平上為研究藏羚羊低氧適應(yīng)打下基礎(chǔ)。
　　前期研究發(fā)現(xiàn)在長期的進(jìn)化過程中，藏羚羊在呼吸、循環(huán)，等多方面形成了獨特的適應(yīng)高原低溫、低氧環(huán)境的生理機制。本研究生理學(xué)指標(biāo)測定結(jié)果顯示：藏羚羊與藏綿羊、低海拔綿羊的體重兩兩比較無明顯差異（P>0.05）；藏羚羊Hb含量、HR及mPAP值均較藏綿羊低，差異有顯著性統(tǒng)計學(xué)意義

7、（P＜0.01）；與低海拔綿羊比較發(fā)現(xiàn)，藏羚羊HR顯著低于低海拔綿羊,而Hb和mMPAP值接近，且無明顯差異（P>0.05）。此外，低海拔綿羊的Hb和mPAP均低于藏綿羊（P＜0.05），而藏綿羊HR低于低海拔綿羊，但統(tǒng)計學(xué)無明顯差異（P>0.05）。ELISA法測定血清中的ET-1含量結(jié)果顯示：藏羚羊組ET-1含量低于藏綿羊組，差異有顯著性統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）；與低海拔綿羊組相比無明顯差異，藏綿羊組與低海拔綿羊組相比無明顯差異。