IL-17F對大鼠成骨細(xì)胞的作用及與ERK1-2的關(guān)系.pdf

1、目的:
　　本實(shí)驗(yàn)在課題組前期對骨質(zhì)疏松大鼠成骨細(xì)胞代謝變化的研究基礎(chǔ)上，以IL-17F干預(yù)大鼠成骨細(xì)胞，進(jìn)一步探究IL-17F對大鼠成骨細(xì)胞礦化功能的影響，以及對特異性轉(zhuǎn)錄因子Osterix及相關(guān)調(diào)節(jié)因子Runx2蛋白表達(dá)及對ERK通路激酶ERK1/2磷酸化水平的影響，探討IL-17F對成骨細(xì)胞有否直接作用，及是否影響MAPK/ERK通路的激活，揭示其作用機(jī)制。
　　方法:
　　1.大鼠成骨細(xì)胞的分離、培養(yǎng)和鑒定

2、r>　　采用酶消化法和組織塊培養(yǎng)法分離提取新生24h內(nèi)Wistar大鼠顱蓋骨原代成骨細(xì)胞，采用差速貼壁法進(jìn)行細(xì)胞純化。用倒置相差顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)、生長情況，并采用堿性磷酸酶染色（鈣鈷法）進(jìn)行細(xì)胞鑒定，取第4代成骨細(xì)胞進(jìn)行研究。
　　2.實(shí)驗(yàn)分組與處理
　　將第4代的成骨細(xì)胞進(jìn)行分組處理和指標(biāo)檢測:
　　2.1采用茜素紅染色法檢測IL-17F對成骨細(xì)胞礦化功能的影響分為兩組:對照組和IL-17F組。對照組用含10％胎牛

3、血清低糖DMEM培養(yǎng)基，實(shí)驗(yàn)組在培養(yǎng)基中加入100ng/mL IL-17F。培養(yǎng)10d后，用pH4.3，0.1％茜素紅染液進(jìn)行礦化結(jié)節(jié)染色。
　　2.2采用Western blot法檢測Runx2、Osterix蛋白表達(dá)和ERK1/2磷酸化水平。
　　第一步，根據(jù)培養(yǎng)基中加入IL-17F的濃度分為6組:0ng/mL組（對照組）、1ng/mL組、10ng/mL組、20ng/mL組、50ng/mL組和100ng/mL組。3d后采

4、用Western blot法檢測成骨細(xì)胞中Runx2、Osterix蛋白表達(dá)和ERK1/2磷酸化水平。
　　第二步，根據(jù)干預(yù)因素不同分為3組:對照組、DMSO組和U0126組。對照組用含10％胎牛血清低糖DMEM培養(yǎng)基，DMSO組和U0126組分別在培養(yǎng)基中加入10uM DMSO和10uM ERK信號通路抑制劑U0126（U0126溶解在DMSO溶液中）。24h后采用Western blot法檢測成骨細(xì)胞Runx2、Osterix

5、蛋白表達(dá)和ERK1/2磷酸化水平。
　　第三步，根據(jù)以上兩部分實(shí)驗(yàn)結(jié)果將細(xì)胞分為3組:對照組、IL-17F+U0126組和U0126組。對照組用含10％胎牛血清低糖DMEM培養(yǎng)基，IL-17F+U0126組和U0126組分別在培養(yǎng)基中加入100ng/mL IL-17F+10uM U0126、10uMU0126。24h后采用Western blot法檢測各組成骨細(xì)胞Runx2、Osterix蛋白表達(dá)和ERK1/2磷酸化水平。

6、　　結(jié)果:
　　鏡下觀察和堿性磷酸酶染色鑒定法均顯示酶消化法和組織塊培養(yǎng)法均能得到純度在90％以上的成骨細(xì)胞。與對照組相比，IL-17F組成骨細(xì)胞礦化染色陽性區(qū)域明顯增多，呈橘紅色點(diǎn)狀、片狀或塊狀。
　　1.不同濃度IL-17F對Runx2、Osterix蛋白的表達(dá)和ERK1/2磷酸化水平的影響
　　與對照組相比，1ng/mL組、10ng/mL組和20ng/mL組成骨細(xì)胞中Runx2、Osterix蛋白的表達(dá)和ERK1

7、/2磷酸化水平無明顯變化（P＞0.05）;50ng/mL組成骨細(xì)胞中Runx2、Osterix蛋白的表達(dá)和ERK1/2磷酸化水平均升高，分別是對照組的1.16±0.22、1.219±0.13和1.317±0.07倍，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）;100ng/mL組Runx2、Osterix蛋白的表達(dá)和ERK1/2磷酸化水平均升高，分別是對照組的1.245±0.31、1.424±0.11和1.355±0.04倍，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜

8、0.05）。與50ng/mL組相比，100ng/mL組成骨細(xì)胞中Runx2、Osterix蛋白的表達(dá)升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。
　　2.DMSO和U0126對成骨細(xì)胞中Runx2、Osterix蛋白表達(dá)和ERK1/2磷酸化水平的影響
　　與對照組相比，DMSO組成骨細(xì)胞中Runx2、Osterix蛋白的表達(dá)和ERK1/2磷酸化水平無明顯變化（P＞0.05）;U0126組成骨細(xì)胞中Runx2、Osterix蛋白的

9、表達(dá)和ERK1/2磷酸化水平均下降，分別占對照組的(72.91±0.04)％、(84.32±0.13)％和(78.80±0.16)％，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。與DMSO組相比，U0126組成骨細(xì)胞中Runx2、Osterix蛋白的表達(dá)和ERK1/2磷酸化水平均下降，分別占DMSO組的(70.2±0.03)％、(83.4±0.08)％和(79.2±0.12)％，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。
　　3.U0126對IL-

10、17F促Runx2、Osterix蛋白表達(dá)和ERK1/2磷酸化水平的影響
　　與對照組相比，IL-17F組成骨細(xì)胞中Runx2、Osterix蛋白的表達(dá)和ERK1/2磷酸化水平均升高，分別是對照組的1.354±0.07、1.575±0.05和1.653±0.01倍，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。與IL-17F組相比， IL-17F+ U0126組成骨細(xì)胞中Runx2、Osterix的蛋白表達(dá)和ERK1/2磷酸化水平均下降，分別

11、占IL-17F組(74.4±0.09)％、(70.7±0.11)％和(61.3±0.02)％，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。與對照組相比，IL-17F+ U0126組成骨細(xì)胞中Runx2、Osterix蛋白的表達(dá)和ERK1/2磷酸化水平均無明顯變化（P＞0.05）。
　　結(jié)論:
　　1.IL-17F能顯著促進(jìn)大鼠成骨細(xì)胞礦化功能、促進(jìn)Runx2、Osterix蛋白的表達(dá)、提高ERK1/2磷酸化水平;ERK信號通路的抑制劑