堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子對(duì)Aβ-,25-35-誘導(dǎo)PC12細(xì)胞ERK1-2和PKCγ活性影響.pdf

1、阿爾茨海默病(AD病)是一種伴有腦特征性病理及生化變化的認(rèn)知功能障礙的臨床綜合癥。AD常發(fā)生在老年人群，目前已成為繼心臟病，腫瘤和中風(fēng)之后的第四位死亡原因。 成纖維細(xì)胞成長(zhǎng)因子(FGF)是一種由多種多肽因子組成的一個(gè)家庭，堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(bFGF)是其中的一員，其信號(hào)傳導(dǎo)復(fù)雜，生物學(xué)作用具多效性。 bFGF受體屬酪氨酸蛋白激酶受體家族中的一員，由細(xì)胞外區(qū)，跨膜區(qū)和細(xì)胞內(nèi)區(qū)組成，信號(hào)傳導(dǎo)途徑包括：1、PKC途徑2、

2、Ras/Raf/MEK/ERK途徑3、JAK/STAT途徑4、PI3K途徑。 基底前腦膽堿能神經(jīng)元變性是AD的重要病理特征，其病變程度和AD學(xué)習(xí)記憶減退相一致。國(guó)外一些研究表明，AD患者腦中膽堿能激動(dòng)劑誘導(dǎo)的PI信號(hào)系統(tǒng)嚴(yán)重?fù)p傷，包括受體G蛋白功能，IPS與其受體的結(jié)合及蛋白激酶C活性均明顯降低；AD患者腦中存在ERK下調(diào)機(jī)制，可能參與神經(jīng)元退行性變的自我刺激過程以及這些條件下的錯(cuò)誤修復(fù)。 目前，尚無bFGF對(duì)AD信號(hào)傳

3、導(dǎo)途徑影響的報(bào)道。這里，我們用Aβ25-35誘導(dǎo)PC12細(xì)胞建立AD細(xì)胞模型，探討bFGF對(duì)AD模型細(xì)胞PKCγ和ERK1/2活性的影響，通過干預(yù)不同信號(hào)傳導(dǎo)途徑可望為AD治療提供新的思路與途徑。 實(shí)驗(yàn)方法： 1、PC12細(xì)胞培養(yǎng)及傳代 用含10％馬血清、5％胎牛血清、100U/ml青霉素以及100μg/l鏈霉素的RPMI-1640培養(yǎng)基培養(yǎng)PC12細(xì)胞，放置于37℃，5％CO2培養(yǎng)箱中，兩天換液一次，當(dāng)PC12

4、細(xì)胞覆蓋瓶面密度達(dá)80％以上，吸出培養(yǎng)液，0.25％胰蛋白酶消化，吹打細(xì)胞并將細(xì)胞懸液倒入2個(gè)新的培養(yǎng)瓶，5-6天傳代一次。 2、實(shí)驗(yàn)分組： 將細(xì)胞分為4組。1、對(duì)照組：常規(guī)加入培養(yǎng)液。2、Aβ?lián)p傷組：加入培養(yǎng)液及老化的Aβ25-35。3、bFGF組：加入培養(yǎng)液、bFGF及老化的Aβ25-35。4、抑制劑組：加入培養(yǎng)液、PD98059、bFGF及老化的Aβ25-35。 3、MTT法檢測(cè)細(xì)胞存活率 將PC1

5、2細(xì)胞接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，分組加藥，設(shè)空白對(duì)照組，每組3復(fù)孔，培養(yǎng)24小時(shí)。加入MTT20μl培養(yǎng)4小時(shí)，加入DMS0150μl，30分鐘后，用酶標(biāo)儀在570nm處讀取各組細(xì)胞的吸光值(OD值)。 4、WestenBlot印跡分析 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，以5×106個(gè)細(xì)胞/孔接種于6孔板，分組加藥，每組設(shè)3復(fù)孔，在培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24小時(shí)。用細(xì)胞刮刀刮取細(xì)胞，PBS沖洗，加入裂解液，采用WestenBlot印跡分析，Ecl系

6、統(tǒng)顯影，ImageJ顯像分析系統(tǒng)對(duì)印跡區(qū)帶進(jìn)行定量分析，測(cè)定PKCγ和P-ERK1/2蛋白表達(dá)。 5、統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 使用SPSS12.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，各組資料用One-wayANOVA方法比較，統(tǒng)計(jì)分析用t檢驗(yàn)，認(rèn)為P＜0.05結(jié)果有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 實(shí)驗(yàn)結(jié)果： 1、MTT法檢測(cè)細(xì)胞存活率：Aβ?lián)p傷組與對(duì)照組相比OD值及細(xì)胞存活率顯著降低，而bFGF組與Aβ?lián)p傷組相比OD值及細(xì)胞存活率顯著升高。 2

7、、WestenBlot結(jié)果 (1)AB損傷組較對(duì)照組ERK1/2，PKCγ活力均顯著下降。 (2)bFGF組較Aβ?lián)p傷組ERK1/2，PKCγ活力顯著增強(qiáng)，并與bFGF濃度呈正相關(guān)。 (3)抑制劑組較bFGF組ERK1/2，PKCγ活力顯著下降，并與PD98059濃度呈正相關(guān)。 結(jié)論： 1、bFGF對(duì)AD模型細(xì)胞損傷具一定保護(hù)作用。 2、bFGF能增強(qiáng)AD模型細(xì)胞ERK1/2和PKCγ活性