ERK1-2和P-ERK1-2在膽管癌組織中的表達及臨床意義.pdf

1、膽管癌是一類嚴(yán)重威脅人類健康的消化道惡性腫瘤,且發(fā)病率逐年攀升。與許多其它惡性腫瘤一樣,膽管癌也是一種與癌基因激活和抑癌基因失活、細(xì)胞凋亡誘發(fā)基因和抑制基因調(diào)控失衡有關(guān)的、以細(xì)胞失控增殖為主要特征的基因病。而癌基因和抑癌基因的變異引起細(xì)胞內(nèi)信號通路失調(diào)則是膽管細(xì)胞癌變的主要機制之一,因此對膽管癌的發(fā)生和惡性進展過程中涉及到的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)的研究顯得非常重要。研究結(jié)果顯示多條信號傳導(dǎo)通路(如VEGF信號系統(tǒng),酪氨酸激酶受體相關(guān)信號系統(tǒng))均可

2、誘導(dǎo)膽管細(xì)胞癌變過程發(fā)生,其中Ras/Raf/MEK/ERK信號通路十分重要。胞外信號調(diào)節(jié)激酶(extracellular signal-regulated ki-nase,ERK)是絲裂原活化蛋白激酶(mitogen activated protein kirtles,MAPK)家族成員之一,ERK家族有5個亞族,包括ERK1-ERK5。其中ERK1和ERK2途徑是ERK家族中研究最廣泛徹底的,屬于絲氨酸/蘇氨酸殘基的蛋白激酶,是細(xì)胞

3、信號傳導(dǎo)的重要途徑。能將多種細(xì)胞外信號(如生長因子、細(xì)胞因子、腫瘤啟動因子等)通過磷酸化活化逐級傳遞至細(xì)胞核,并激活多種核轉(zhuǎn)錄因子,參與細(xì)胞生長、發(fā)育、分裂及分化等。ERK1/2磷酸化后即P-ERK1/2,進入細(xì)胞核作用于Elk-1、c-myc、c-fos、c-jun、NF-κB等轉(zhuǎn)錄因子可磷酸化核轉(zhuǎn)錄因子和其他蛋白激酶等多種底物,調(diào)節(jié)相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄,進而參與細(xì)胞生長、發(fā)育、分裂及細(xì)胞間的功能同步等多種生理過程,并在細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化等病理過

4、程中起重要作用。
　　 因此研究ERK1/2、P-ERK1/2兩者在膽管癌中的表達,以及與膽管癌生物學(xué)行為的關(guān)系,具有重要的臨床意義和社會價值。這也是我們開展此研究的目的所在。
　　 材料和方法：
　　 一、一般資料：標(biāo)本來源選擇中國醫(yī)科大學(xué)附屬盛京醫(yī)院病理科存檔石蠟包埋標(biāo)本(2005年1月-2009年10月)手術(shù)切除原發(fā)性肝外膽管癌標(biāo)本74例。所有標(biāo)本術(shù)前均未進行放化療,并經(jīng)病理確診膽管癌組織,對照為25例膽囊

5、結(jié)石膽囊管組織。病例標(biāo)本中男性例數(shù)為:45例,女性標(biāo)本為:29人,年齡23～73歲,平均61歲。按膽管癌病理分級:高分化23例,中分化37例,低分化14例。淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移44例,無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者為30例。按UICC分期標(biāo)準(zhǔn)進行分期,Ⅰ期24例,Ⅱ期25例,Ⅲ～Ⅳ期25例。對照組病例中男性例數(shù)為:15例,女性標(biāo)本為:10人,年齡18～68歲。
　　 二、實驗方法及試劑：
　　 (一)主要試劑：鼠抗人ERK1/2和P-ERK1/2

6、單克隆抗體購自NeoMarker公司；兔抗人HER-2多克隆抗體購自武漢博士德公司；SP試劑盒、DAB顯色劑均購自北京中杉金橋公司。
　　 (二)實驗方法：用S-P法免疫組化染色,ERK1/2和P-ERK1/2一抗稀釋度均為1:100,二抗稀釋度均為1:200。陰性對照采用PBS液代替一抗,陽性對照采用北京中杉金橋公司提供的陽性片。
　　 (三)觀察：由兩位有經(jīng)驗對病情不了解的病理科醫(yī)生觀察染色結(jié)果,ERK1/2的陽性著

7、色為細(xì)胞質(zhì)內(nèi)出現(xiàn)黃色或棕黃色顆粒；P-ERK1/2陽性表達為細(xì)胞核或細(xì)胞質(zhì)出現(xiàn)黃色或棕黃色顆粒。在高倍鏡下(×400)隨機選擇5個視野,各計數(shù)200個細(xì)胞,共計1000個,觀察著色強度并計算每張切片陽性細(xì)胞百分率。ERK1/2陽性分級標(biāo)準(zhǔn):先按著色強度:無色0分,淺黃色1分,棕黃色2分,棕褐色3分；再按陽性細(xì)胞所占百分比,無陽性細(xì)胞數(shù)為0分,陽性細(xì)胞數(shù)＜10％為1分,10％～50％為2分,＞50％為3分,參考Cooper等的報道:著色強

8、度與陽性細(xì)胞百分比的乘積:0～3分為陰性(-),4～6分為弱陽性(+),7～9分為強陽性(++)。P-ERK1/2陽性分級標(biāo)準(zhǔn):先按著色強度:無色0分,淺黃色1分,棕黃色2分,棕褐色3分;再按陽性細(xì)胞所占百分比,參考Zhong等的報道:無陽性細(xì)胞數(shù)為0分,陽性細(xì)胞數(shù)＜1％為1分,1％～10％為2分,10％～50％為3分,＞50％為4分；著色強度與陽性細(xì)胞百分比的乘積:0～3分為陰性(一),4～6分為弱陽性(+),7～9分為中度陽性(++

9、),10～12分為強陽性(+++)。
　　 (四)隨訪結(jié)果：定義從手術(shù)后到病人死亡的時間為生存時間,時間的測度單位(月)。設(shè)定2010年9月1日為截止隨訪日,對于中途失訪患者,其終止時間以最后一次訪問時間為準(zhǔn)。采用電話隨訪跟蹤,失訪16例,因膽管癌死亡50例,失訪者為失去聯(lián)系患者。
　　 (五)統(tǒng)計學(xué)處理：采用SPSS13.0統(tǒng)計軟件包處理數(shù)據(jù)。ERK1/2和P-ERK-1/2表達水平與臨床指標(biāo)相關(guān)性采用Pearson卡

10、方檢驗,應(yīng)用Kaplan-Meier法繪制生存曲線,單因素分析采用Kaplan-Meier模型,多因素分析采用COX比例風(fēng)險模型,P＜0.05為有統(tǒng)計學(xué)意義。
　　 結(jié)果：
　　 一、ERK1/2和P-ERK1/2在膽管癌組織中表達情況：74例肝外膽管癌組織中ERK1/2和P-ERK1/2蛋白陽性表達率分別為32.4％(24/74)和60.8％(45/74)(圖1-7)；在25例正常肝外膽管組織中,ERK1/2和P-ER

11、K1/2蛋白表達陽性表達率分別為16％(4/25)和24％(6/25)(圖8)；與正常肝外膽管組織比較,膽管癌組織ERK1/2和P-ERK1/2蛋白表達陽性表達率均顯著高于正常肝外膽管組織(P＜0.05)。
　　 二、ERK1/2和P-ERK1/2表達與膽管癌臨床病理參數(shù)相關(guān)性：ERK1/2蛋白表達與肝外膽管癌患者年齡、性別、腫瘤大小、臨床分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、分化程度比較后,均未見相關(guān)性。P-ERK1/2蛋白表達與肝外膽管癌患者淋

12、巴結(jié)轉(zhuǎn)移和分化程度密切相關(guān):淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者肝外膽管癌組織中P-ERK1/2蛋白表達陽性率明顯高于未發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移膽管癌患者(76.7％vs.50％,x2=5.323,P=0.021)；P-ERK1/2蛋白表達陽性在分化程度低的膽管癌組織中表達明顯高于分化程度高的患者(x2=8.435,P=0.015)。P-ERK1/2蛋白表達與腫瘤大小、患者年齡、性別比較均未見相關(guān)性(表1)。
　　 三、ERK1/2和p-ERK1/2表達與膽管

13、癌患者預(yù)后的相關(guān)性：為了觀察ERK1/2和P-ERK1/2表達與肝外膽管癌患者預(yù)后的相關(guān)性,我們對ERK1/2和P-ERK1/2表達與肝外膽管癌患者的總體生存期進行了統(tǒng)計分析,生存分析結(jié)果顯示,ERK1/2表達水平與肝外膽管癌患者的總體生存期無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05,圖9):P-ERK1/2表達陽性患者總體生存期明顯短于P-ERK1/2表達陰性的肝外膽管癌患者(P=0.034,圖10)
　　 結(jié)論：膽管癌組織存在ERK1/2和