西酞普蘭預處理對慢性應激大鼠探究行為、空間記憶及腦內(nèi)信號分子ERK1-2、CREB磷酸化水平的影響.pdf

1、隨著社會的發(fā)展和各方面競爭壓力的增加，負性應激，特別是負性心理應激已成為一個不可忽視的因素威脅著人們的健康。超過個體承受能力的負性心理應激，往往是多種疾病的根源，特別是精神疾患，如抑郁癥。因此，研究負性心理應激的中樞機制及抗應激藥物的生物學效應對應激相關性精神障礙的防治具有十分重要的意義。然而，與心理社會應激相關的中樞環(huán)路及抗應激藥物的作用機制目前尚未完全明確，是現(xiàn)今醫(yī)學有待解決的重要問題之一。 已知細胞外信號調(diào)節(jié)激酶( ext

2、racellular signal-regulated kinase1/2,ERK1/2)是促分裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase, MAPK）家族中的重要成員，該家族的信號轉(zhuǎn)導通路對調(diào)節(jié)神經(jīng)細胞的生長、增殖、分化和存活起關鍵作用。近年來發(fā)現(xiàn)，信號轉(zhuǎn)導分子ERK1/2 在應激誘發(fā)的腦內(nèi)神經(jīng)元活動中具有重要作用，其磷酸化已被作為一個新的神經(jīng)元活動的標志物用于功能形態(tài)學研究。而環(huán)磷酸腺苷反應單

3、元結(jié)合蛋白（cAMPresponse element binding protein, CREB）是一種重要的核蛋白，屬于結(jié)構(gòu)相關轉(zhuǎn)錄因子CREB 家族成員之一，其調(diào)節(jié)啟動子中具有環(huán)磷酸腺苷反應單元(cAMP response element，CRE)的基因轉(zhuǎn)錄。這種核轉(zhuǎn)錄因子具有調(diào)節(jié)包括學習記憶在內(nèi)的廣泛的生物學功能，是細胞內(nèi)多種信號通路的一種關鍵成分。 包括環(huán)磷酸腺苷（cyclic adenosine monophospha

4、te, cAMP）通路、Ras/ERK 通路等在內(nèi)的多種信號轉(zhuǎn)導通路均涉及CREB 的磷酸化及其活化作用。CREB是一個潛在的轉(zhuǎn)錄活化劑，其表達和/或活性的變化，會影響包括腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子（brain-derived neurotrophic factor, BDNF）在內(nèi)的多種下游靶基因的調(diào)節(jié)，從而影響抗心境障礙藥物的總體效應。 本研究在建立大鼠慢性束縛應激模型的基礎上，運用曠場試驗、Morris水迷宮等行為學方法及蛋白免疫

5、印跡分析（Western blot）和免疫組織化學方法，探討大鼠慢性束縛應激后探究行為、空間記憶能力的改變及腦內(nèi)應激相關核團ERK1/2、CREB 磷酸化水平的變化；同時觀察應激前和應激期間預防性給予5-羥色胺再攝取抑制劑（selective serotonin reuptake inhibitor, SSRIs）－西酞普蘭（citalopram）對大鼠上述變化的影響，為闡明負性應激中樞機制提供理論依據(jù)，并為臨床治療及預防應激相關精神障

6、礙時選擇藥物提供新思路。 目的： 1. 單純及預防性給予大鼠SSRIs對其探究行為、空間記憶能力的影響。 2. 慢性束縛應激大鼠額前葉皮質(zhì)（prefrontal cortex, PFC）中磷酸化ERK1/2（phosphorylated-ERK1/2, p-ERK1/2）、總ERK1/2 水平的變化。 3. 應激前和應激期間預防性給予SSRIs 對大鼠腦內(nèi)應激相關核團中ERK1/2、CREB 磷酸化水平的

7、影響。 方法： 1. 單純及預防性給予大鼠SSRIs 對其探究行為、空間記憶能力的影響雄性SD 大鼠隨機分為4 組：正常對照組（normal control, NC, N=6），束縛應激組（restraint stress, RS, N=6），單純西酞普蘭組（only citalopram, OC,N=6）及西酞普蘭預處理組（citalopram prophylaxis, CP, N=6）。RS 組動物腹腔內(nèi)注射(int

8、raperitoneal, I.p.)生理鹽水，1 ml/d，OC 組和CP 組動物腹腔內(nèi)注射西酞普蘭，10 mg/(kg?d)，連續(xù)7 d。然后對RS 組和CP 組動物均給予束縛應激，方法為每天9:00-15:00 將大鼠置于特制的束縛器內(nèi)限制其行動自由，連續(xù)21d。在束縛期間禁食，禁水。應激期間RS 組和CP 組每日束縛前分別給予生理鹽水和西酞普蘭，OC 組相同時間給予西酞普蘭，劑量同束縛應激前。NC 組和OC 組動物僅在其它兩組動

9、物每日應激相應時間也禁食，禁水，未進行束縛應激處理。束縛應激結(jié)束后當日對大鼠進行曠場測試；束縛實驗結(jié)束前1 w 開始利用Morris 水迷宮對大鼠進行空間記憶訓練，束縛應激結(jié)束當日對大鼠進行空間記憶能力測試。 2. 慢性束縛應激大鼠PFC 中p-ERK1/2、總ERK1/2 水平的變化雄性SD 大鼠隨機分為2 組： NC 組（N=3），RS 組（N=3）。實驗方法同1。束縛應激結(jié)束后，所有大鼠迅速斷頭處死。觀察兩組大鼠PFC 中

10、p-ERK1/2 和總ERK1/2 水平的變化。 3. 預防性給予SSRIs 對大鼠腦內(nèi)應激相關核團中ERK1/2、CREB 磷酸化水平的影響雄性SD 大鼠隨機分為3 組： NC 組（N=6），RS 組（N=6）及CP 組（N=6）。 各組動物實驗方法同1。束縛應激結(jié)束后，所有大鼠立即處死。觀察各組大鼠腦內(nèi)應激相關腦區(qū)、核團中ERK1/2、CREB 磷酸化水平的變化。 結(jié)果： 1. 單純及預防性給予大鼠S

11、SRIs 對其探究行為、空間記憶能力的影響經(jīng)過21 d 慢性束縛應激后，與NC 組相比， RS 組大鼠曠場試驗的水平活動度明顯減少，中央停留時間明顯增加，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）； OC 組大鼠的曠場試驗行為沒有明顯變化。CP 組大鼠曠場試驗的水平活動度較RS 組顯著增加，中央時停留間則明顯減少，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。 經(jīng)過21 d 慢性束縛應激后，與NC 組相比，RS 組大鼠的目標象限活動時間和穿越

12、站臺次數(shù)明顯減少，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）；OC 組大鼠的檢測結(jié)果無明顯變化。CP 組大鼠目標象限活動時間和穿越站臺次數(shù)較RS 組顯著增加，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。 2. 慢性束縛應激大鼠PFC 中p-ERK1/2、總ERK1/2 水平的變化RS 組大鼠PFC 中p-ERK1/2 水平較NC 組低，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05），而總ERK1/2 的水平?jīng)]有明顯改變。 3. 預防性給予SSRIs 對大

13、鼠腦內(nèi)應激相關核團中ERK1/2、CREB 磷酸化水平的影響p-ERK1/2 陽性細胞在NC 組大鼠腦內(nèi)分布較為廣泛，我們著重觀察了一些與應激相關的腦區(qū)、核團。在PFC、杏仁內(nèi)側(cè)核（medial amygdaloid nucleus,MeA）、杏仁皮質(zhì)后內(nèi)側(cè)核（posteromedial cortical amgydala nucleus, PMCo）、隔區(qū)的外側(cè)核腹側(cè)部（lateral septal nucleus, ventral

14、part, LSV）及終紋床核（bednucleus of the stria terminalis, BNST）均有較多p-ERK1/2 陽性細胞分布。RS組大鼠的PFC、MeA、PMCo、LSV 及BNST 中p-ERK1/2 陽性細胞數(shù)較NC組明顯減少，細胞染色較淺，突起染出少，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。 CP 組大鼠在以上各腦區(qū)、核團中p-ERK1/2 陽性細胞數(shù)較RS 組明顯增多，細胞染色濃，突起染出多，差異有

15、統(tǒng)計學意義（P<0.05）。同樣，磷酸化CREB（phosphorylated-CREB, p-CREB）陽性細胞在NC組大鼠腦內(nèi)分布也較為廣泛。其中PFC 內(nèi)的陽性細胞數(shù)量多，位于皮質(zhì)淺層。 海馬齒狀回（DG）、杏仁中央核（central amygdaloid nucleus, CeA）、MeA 和PMCo 也有較多的p-CREB 陽性細胞表達。RS 組大鼠在上述腦區(qū)、核團中p-CREB 陽性細胞數(shù)較NC 組明顯減少，染色淺，

16、差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。 CP 組大鼠在以上各腦區(qū)、核團中p-CREB 陽性細胞數(shù)較RS 組明顯增多，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。 結(jié)論： 1. 慢性束縛應激后大鼠的探究行為及空間記憶明顯受損；應激前和應激期間預防性給予西酞普蘭處理，能明顯緩解應激對大鼠行為學改變造成的不良影響而發(fā)揮抗負性應激作用；而單純給予大鼠西酞普蘭沒有影響大鼠在曠場及Morris 水迷宮中的表現(xiàn)。 2. 慢性束縛應激

17、后大鼠PFC 內(nèi)p-ERK1/2 水平明顯降低，而總ERK1/2 水平?jīng)]有改變，提示信號分子ERK1/2 磷酸化可能與負性應激的中樞機制有關。 3. 慢性束縛應激改變了大鼠PFC、CeA、MeA、PMCo、DG 、LSV 及BNST等部位ERK1/2 及CREB 磷酸化的水平，這一結(jié)果提示上述腦區(qū)、核團可能與負性應激的中樞調(diào)控有關，而ERK1/2、CREB 信號轉(zhuǎn)導通路參與了其調(diào)控過程；預防性給予大鼠西酞普蘭能夠增加上述腦區(qū)、核