慢性應(yīng)激大鼠腦內(nèi)CREB與IL—18表達(dá)水平及腦影像學(xué)的研究.pdf

1、前言：目前醫(yī)學(xué)界普遍認(rèn)為抑郁癥是一個(gè)與遺傳因素有關(guān)的，由環(huán)境因素所致的多基因性疾病。研究顯示它并不是完全的功能性精神障礙，部分抑郁癥患者大腦特定部位的結(jié)構(gòu)性損害可能就是其抑郁情緒產(chǎn)生的物質(zhì)基礎(chǔ)。應(yīng)激性生活事件是抑郁癥的明顯誘發(fā)因素，且與抑郁癥狀的嚴(yán)重程度有關(guān)。當(dāng)機(jī)體感受應(yīng)激源時(shí)，下丘腦—垂體—腎上腺軸(HPA軸)興奮性提高，腎上腺皮質(zhì)分泌應(yīng)激激素糖皮質(zhì)類固醇(GC)升高，隨著應(yīng)激時(shí)程的延長，HPA軸功能持續(xù)亢進(jìn)，導(dǎo)致高皮質(zhì)醇血癥。有關(guān)實(shí)

2、驗(yàn)發(fā)現(xiàn)持續(xù)的高皮質(zhì)醇血癥可導(dǎo)致海馬神經(jīng)元的萎縮、退化和丟失，最終出現(xiàn)一系列的行為效應(yīng)，如記憶、認(rèn)知和行為的改變，這可能是抑郁癥臨床表現(xiàn)產(chǎn)生的原因之一。 海馬是介導(dǎo)應(yīng)激反應(yīng)的最重要腦區(qū)之一，也是應(yīng)激激素作用的主要靶區(qū)。許多實(shí)驗(yàn)已證明，應(yīng)激可引起海馬結(jié)構(gòu)和功能的改變，而海馬的損害又在慢性應(yīng)激時(shí)的高皮質(zhì)醇血癥中起重要作用。環(huán)磷酸腺苷—環(huán)磷酸腺苷反應(yīng)元件結(jié)合蛋白(cAMP-CREB)通路的激活能調(diào)節(jié)BDNF的表達(dá)并促進(jìn)神經(jīng)元的再生；白介

3、素-18(IL-18)會(huì)破壞海馬CA1區(qū)的長時(shí)程增強(qiáng)(LTP)及N-甲基-D-天冬氨酸(NMDA)受體的傳遞。本研究分別以CREB和IL-18作為神經(jīng)元的保護(hù)性因素和損害性因素，探討二者的表達(dá)水平與神經(jīng)元結(jié)構(gòu)、功能改變之間的關(guān)系，幫助揭示抑郁癥的發(fā)病機(jī)制，為臨床開展抑郁癥的病因?qū)W治療提供依據(jù)。 材料與方法：一、實(shí)驗(yàn)材料1、實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：采用中國醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物部提供的青年雄性Wistar大鼠30只，體重在185g～255g之間。

4、 2、主要實(shí)驗(yàn)試劑：兔抗大鼠pCREB(磷酸化CREB)多克隆抗體，兔抗大鼠IL-18多克隆抗體，生物素標(biāo)記的山羊抗兔IgG，SABC(鏈霉親和素—過氧化物復(fù)和物)免疫組化試劑盒，以上均購于Boster公司；DAB顯色劑購于Sigma公司。 3、主要實(shí)驗(yàn)儀器：YSD-4G型藥理生理實(shí)驗(yàn)多用儀(安徽蚌埠醫(yī)學(xué)院無線電工廠)；MetaMorph/CoolSnapfx/Ax70計(jì)算機(jī)圖像分析系統(tǒng)；1.5T磁共振機(jī)(日本TOSHIBA

5、公司)。 二、實(shí)驗(yàn)方法1、動(dòng)物分組將全部大鼠喂養(yǎng)一周以適應(yīng)環(huán)境，稱重、Open-field(開場實(shí)驗(yàn))法測定其行為及對(duì)大鼠頭部進(jìn)行磁共振(MR)掃描(橫斷面T1、T2加權(quán)及矢狀面T1加權(quán))，之后將大鼠隨機(jī)分為對(duì)照組C和實(shí)驗(yàn)組T，每組各15只大鼠。 2.應(yīng)激過程對(duì)照組大鼠分3籠喂養(yǎng)，在實(shí)驗(yàn)的第1-21天不給予任何刺激，第22天進(jìn)行稱量體重、開場實(shí)驗(yàn)法評(píng)分和頭部磁共振掃描。實(shí)驗(yàn)組大鼠單籠喂養(yǎng)，在實(shí)驗(yàn)的第1-21天每天接受各種

6、不同的應(yīng)激：熱刺激、夾尾、搖晃、電擊足底、冰水強(qiáng)迫游泳、禁食和禁水，第22天進(jìn)行稱量體重，開場實(shí)驗(yàn)法評(píng)分和頭部磁共振掃描。 3.灌流取材與切片使用戊巴比妥鈉給予大鼠腹腔麻醉，經(jīng)左心室快速灌注37℃生理鹽水150ml，繼之持續(xù)灌注4℃的4％多聚甲醛溶液200～250ml，然后剝離腦，后固定48小時(shí)以上，梯度乙醇脫水，石蠟包埋后，行冠狀切片。 4.免疫組化法檢測pCREB和IL-18蛋白。 5.圖像分析每只大鼠選取海

7、馬及韁核較完好的切片各四張，在計(jì)算機(jī)圖像分析系統(tǒng)(MetaMorph/CoolSnapfx/Ax70)上分別測量： ①雙側(cè)海馬CA3區(qū)和齒狀回(DG)內(nèi)pCREB陽性細(xì)胞的平均光密度值； ②雙側(cè)海馬CA1區(qū)及韁核內(nèi)IL-18陽性細(xì)胞的平均光密度值。 6.磁共振圖像分析 閱讀圖像并測量T2加權(quán)圖像的側(cè)腦室寬度及中腦導(dǎo)水管直徑。 7.統(tǒng)計(jì)分析采用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。 實(shí)驗(yàn)結(jié)

8、果一、體重和開場行為測定實(shí)驗(yàn)后的T組與C組相比：體重減輕，中央格停留時(shí)間延長，水平穿越格數(shù)減少，直立次數(shù)減少，修飾次數(shù)減少，糞便粒數(shù)增多(p＜0.05～0.01)。二、光鏡下的神經(jīng)細(xì)胞 光鏡下觀察，C組大鼠CA3區(qū)錐體細(xì)胞和DG顆粒細(xì)胞排列整齊、密集；而T組大鼠的DG顆粒細(xì)胞與C組相比無明顯改變，但CA3區(qū)錐體細(xì)胞排列雜亂、稀疏，數(shù)量有所減少，細(xì)胞間隙增大。 三、實(shí)驗(yàn)結(jié)束后大鼠海馬中pCREB的表達(dá)在海馬CA3區(qū)及DG，

9、兩組均有陽性表達(dá)，但T組的平均光密度值比C組顯著減少(p均＜0.01)。 四、實(shí)驗(yàn)結(jié)束后大鼠腦中IL-18的表達(dá)在海馬CA1區(qū)和韁核，兩組均有陽性表達(dá)，但T組的平均光密度值比C組顯著增加(p均＜0.01)。 五、大鼠頭部磁共振圖像所見頭部MR橫斷面T1及T2加權(quán)圖像：C組大鼠實(shí)驗(yàn)前后側(cè)腦室及中腦導(dǎo)水管無明顯變化；T組大鼠實(shí)驗(yàn)后側(cè)腦室較實(shí)驗(yàn)前明顯擴(kuò)張、中腦導(dǎo)水管較實(shí)驗(yàn)前明顯增粗。 2、頭部MR矢狀面T1加權(quán)圖像：C

10、組大鼠實(shí)驗(yàn)前后蛛網(wǎng)膜下腔及腦溝、腦裂無明顯變化；T組大鼠實(shí)驗(yàn)后蛛網(wǎng)膜下腔較實(shí)驗(yàn)前增寬，腦溝、腦裂較實(shí)驗(yàn)前加深。 六、兩組大鼠頭部磁共振掃描結(jié)果比較1、側(cè)腦室寬度：實(shí)驗(yàn)前T組大鼠的側(cè)腦室寬度與C組相比無明顯差異(p＞0.05)；實(shí)驗(yàn)后T組比C組顯著增加(p＜0.01)；T組大鼠在實(shí)驗(yàn)后較實(shí)驗(yàn)前側(cè)腦室寬度顯著增大(p＜0.01)；C組則實(shí)驗(yàn)后與實(shí)驗(yàn)前相比無明顯變化(p＞0.05)。 2、中腦導(dǎo)水管直徑：實(shí)驗(yàn)前T組大鼠的中腦導(dǎo)

11、水管直徑與C組相比無明顯差異(p＞0.05)；實(shí)驗(yàn)后T組比C組顯著增加(p＜0.01)；T組在實(shí)驗(yàn)后比實(shí)驗(yàn)前中腦導(dǎo)水管直徑顯著增大(p＜0.01)；C組則實(shí)驗(yàn)后與實(shí)驗(yàn)前相比無明顯變化(p＞0.05)。 結(jié)論1、慢性綜合應(yīng)激減少大鼠的探究行為，抑制修飾行為，增加排便量。 2、慢性應(yīng)激后，大鼠海馬神經(jīng)元pCREB表達(dá)顯著下降。 3、慢性應(yīng)激后，大鼠海馬神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞IL-18表達(dá)顯著增加，韁核神經(jīng)元IL-18表達(dá)顯著增