PTPN12對心臟HERG鉀通道的酪氨酸磷酸化水平調(diào)控作用的研究.pdf

1、研究背景：
　　長QT綜合征(LQTS),又稱延遲復(fù)極綜合征,主要的臨床表現(xiàn)包括室性心律失常(以尖端扭轉(zhuǎn)性室性心動(dòng)過速、室顫多見)、暈厥和猝死。根據(jù)病因分為先天性或遺傳性長QT綜合征,以及獲得性長QT綜合征兩大類。其中,獲得性長QT綜合征常與電解質(zhì)紊亂、心動(dòng)過緩、心肌缺血及某些藥物等因素相關(guān)。由于導(dǎo)致QT間期延長的因素眾多,和它本身所具有的潛在致命性,因此越來越受到人們的關(guān)注。根據(jù)突變基因的不同,LQTS分為12種類型,分別為LQ

2、T1至LQT12。12種LQTS的致病基因分別為:KCNQ1(LQT1)、KCNH2(LQT2)、SCN5A(LQT3)、ANK2/AnkyrinB(LQT4)、Mink/KCNE1(LQT5)、MiRP1/KCNE2(LQT6)、KCNJ2(LQT7)、CACNA1/Cav2.1(LQT8)、CAV3(LQT9)、SCN4B(LQT10)、AKAP9/Yotiao(LQT11),SNTA1(LQT12)。其中LQT2為第二常見類型,在

3、中國最常見,主要由人類果蠅相關(guān)基因(Human ether-a-go-go-related gene,HERG)的突變所致。HERG基因位于人第7對染色體7q35.36位點(diǎn)。HERG鉀通道電流參與構(gòu)成心肌細(xì)胞動(dòng)作電位3期的主要外向電流,其基因突變可導(dǎo)致鉀離子通道數(shù)量減少或通道功能減退,從而導(dǎo)致QT間期延長。在我們前期的研究中,發(fā)現(xiàn)了非受體型蛋白酪氨酸磷酸酶12(PTPN12)通過與HERG鉀通道相互作用而發(fā)揮調(diào)控HERG鉀通道電流振幅的

4、功能。本課題在既往基礎(chǔ)上進(jìn)一步從酪氨酸磷酸化水平調(diào)控這一角度深入研究PTPN12對HERG鉀通道調(diào)控的機(jī)理。
　　目的：
　　明確PTPN12對HERG鉀通道酪氨酸磷酸化的調(diào)控作用以及該作用對HERG鉀通道電流特性的影響,為深入闡明LQTS的發(fā)病機(jī)理及開發(fā)治療該病的新型蛋白質(zhì)藥物提供理論基礎(chǔ)及新思路。
　　方法：
　　1.應(yīng)用基因定點(diǎn)突變技術(shù),構(gòu)建一個(gè)聯(lián)合位點(diǎn)突變的pCDNA3.0-HERG Y327A-Y700

5、A-Y845A質(zhì)粒,然后基因測序進(jìn)行驗(yàn)證;
　　2.免疫共沉淀和蛋白免疫印跡技術(shù):本研究分為4個(gè)組:
　　a.轉(zhuǎn)染pCDNA3.1-空載體和pCDNA3.0-空載體的HEK293細(xì)胞;
　　b.轉(zhuǎn)染pCDNA3.0-HERG和pCDNA3.1-空載體的HEK293細(xì)胞;
　　c.轉(zhuǎn)染pCDNA3.0-HERGY327A-Y700A-Y845A和pCDNA3.1-PTPN12的HEK293細(xì)胞;
　　d.轉(zhuǎn)染

6、pCDNA3.0-HERG和pCDNA3.1-PTPN12的HEK293細(xì)胞。
　　用RIPA蛋白裂解液提取轉(zhuǎn)染后的HEK293細(xì)胞總蛋白,取等量的細(xì)胞總蛋白,一部分直接用PTPN12抗體進(jìn)行Western Blot分析;另一部分與4G10抗體混合過夜,第二天加入Protein A/G Agarose,振蕩2小時(shí)后離心沉淀,取沉淀物進(jìn)行凝膠電泳,再用抗HERG抗體和4G10抗體進(jìn)行Western Blot分析;
　　3.應(yīng)用

7、膜片鉗技術(shù),檢測不同實(shí)驗(yàn)組中HERG鉀離子通道的電流振幅變化。
　　本研究分為4個(gè)組:
　　1.對照組(轉(zhuǎn)染pCDNA3.0-HERG細(xì)胞組);
　　2.PTPN12過表達(dá)組(共轉(zhuǎn)染pCDNA3.0-HERG和pCDNA3.1-PTPN12細(xì)胞組);
　　3.PTPN12過表達(dá)并PAO干預(yù)組(共轉(zhuǎn)染pCDNA3.0-HERG和pCDNA3.1-PTPN12,并給予磷酸酯酶抑制劑(sodium orthovanad

8、ate,PAO)處理細(xì)胞組);
　　4.PTPN12過表達(dá)并HERG突變組(共轉(zhuǎn)染pCDNA3.0-HERGY327A-Y700A-Y845A和pCDNA3.1-PTPN12,的HEK293細(xì)胞組)。
　　結(jié)果：
　　1.成功構(gòu)建了HERG不同位點(diǎn)的聯(lián)合突變體,并經(jīng)DNA測序證明突變位點(diǎn)的存在;
　　2.免疫共沉淀和蛋白免疫印跡分析發(fā)現(xiàn):相對于HERG單獨(dú)轉(zhuǎn)染組,PTPN12與HERG共轉(zhuǎn)染組的HERG鉀通道酪氨

9、酸磷酸化水平下降2.2倍,PTPN12與HERG突變體共轉(zhuǎn)染組的HERG鉀通道酪氨酸磷酸化水平下降3.7倍。
　　3.膜片鉗檢測發(fā)現(xiàn),PTPN12過表達(dá)組的HERG電流振幅(204.08±17.73pA)明顯低于對照組的HERG電流振幅(399.70±29.58pA),兩組之間的電流振幅差異具有顯著性差異(P<0.010);PTPN12過表達(dá)并PAO干預(yù)組的電流振幅(414.33±26.67pA)明顯高于PTPN12過表達(dá)組的HE

10、RG電流振幅(204.08±17.73pA),兩組的電流振幅差異具有顯著性差異(P<0.010);PTPN12過表達(dá)并HERG突變組的電流振幅(374.25±22.37pA)明顯高于PTPN12過表達(dá)組的HERG電流振幅(204.08±17.73pA),兩組振幅之間的差異具有顯著性差異(P<0.010)。
　　結(jié)論：
　　1.蛋白酪氨酸磷酸酶非受體型12對心臟HERG鉀離子通道的酪氨酸殘基具有去磷酸化作用,對心臟HERG鉀通