腦缺血-再灌注Src介導(dǎo)PSD-95酪氨酸磷酸化的研究.pdf

1、突觸后密集區(qū)蛋白95(postsynaptic density 95；PSD-95)是在興奮性突觸的突觸后密集區(qū)發(fā)現(xiàn)的一種高度表達(dá)的蛋白質(zhì)，在突觸形成早期PSD-95即定位、聚集于突觸后膜，與多種蛋白相互作用，參與調(diào)節(jié)突觸信號(hào)傳遞及突觸可塑性。研究表明，腦缺血/再灌注PSD-95介導(dǎo)了Src家族酪氨酸蛋白激酶(Src family protein tyrosine kinase；SrcPTKs)對(duì)N-甲基-D-天冬氨酸(N-methyl

2、-D-aspartate；NMDA)受體亞基NR2A的酪氨酸磷酸化，增強(qiáng)NMDA受體通道活性，抑制PSD-95蛋白表達(dá)有神經(jīng)保護(hù)作用。為了闡明腦缺血/再灌注PSD-95自身功能調(diào)節(jié)機(jī)制，利用SD大鼠四動(dòng)脈結(jié)扎全腦缺血模型，采用免疫印跡、免疫沉淀的方法觀察了腦缺血/再灌注大鼠海馬組織中PSD-95的酪氨酸磷酸化情況；研究了PTK抑制劑Genistein(Gen)、特異性SrcPTKs抑制劑PP2對(duì)上述腦缺血/再灌注誘導(dǎo)的PSD-95酪氨酸

3、磷酸化水平的影響；進(jìn)行體外共轉(zhuǎn)染活性型Src(aSrc)/非活性型Src(iSrc)與PSD-95及其突變型，觀察PSD-95及其突變型的蛋白表達(dá)及酪氨酸磷酸化情況。 1.腦缺血/再灌注PSD-95的酪氨酸磷酸化調(diào)節(jié) SD大鼠全腦缺血15min或缺血后再灌注6h(I/R6h)，以抗PSD-95抗體免疫沉淀，抗pY抗體免疫印跡，或抗pY抗體免疫沉淀，抗PSD-95抗體免疫印跡，PSD-95的酪氨酸磷酸化水平均顯著升高，分別

4、為假手術(shù)組的5.4、1.7倍。上述情況下，PSD-95的蛋白表達(dá)量無(wú)明顯改變。結(jié)果表明：腦缺血促進(jìn)PSD-95酪氨酸磷酸化水平的升高。 2．Gen、PP2抑制腦缺血／再灌注誘導(dǎo)的PSD-95酪氨酸磷酸化水平的升高，并影響Src與PSD-95的結(jié)合 缺血前20min腹腔注射Gen，或缺血前30min腦室注射PP2，選擇缺血1 5min，I／R6h兩個(gè)時(shí)間點(diǎn)，檢測(cè)大鼠海馬組織中PSD-95的酪氨酸磷酸化情況。結(jié)果顯示，G

5、en和PP2均對(duì)腦缺血／再灌注PSD-95酪氨酸磷酸化水平的升高有明顯的抑制作用，并影響Src與PSD-95的結(jié)合。上述情況下，PSD-95及Src的蛋白表達(dá)量無(wú)明顯變化。結(jié)果表明：腦缺血／再灌注誘導(dǎo)的PSD-95酪氨酸磷酸化水平的升高由SrcPTKs介導(dǎo)。 3．a(chǎn)Src／iSrc對(duì)PSD．95的磷酸化作用 將aSrc／iSrc與PSD-95的表達(dá)載體共轉(zhuǎn)染真核表達(dá)細(xì)胞cos-7，24小時(shí)后收集細(xì)胞，檢測(cè)PSD-95的蛋

6、白表達(dá)及酪氨酸磷酸化情況。結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，與aSrc共表達(dá)的PSD-95發(fā)生了明顯酪氨酸磷酸化。結(jié)果表明：Src介導(dǎo)了PSD-95酪氨酸磷酸化。 4．a(chǎn)Src對(duì)PSD-95突變體的磷酸化作用 將PSD-95突變體與myc的融合蛋白myc．ASG(缺失PSD-95的GK、SH3結(jié)構(gòu)域)、myc-AG(缺失PSD-95的GK結(jié)構(gòu)域)分別與aSrc在COS-7細(xì)胞內(nèi)共表達(dá)；24小時(shí)后收集細(xì)胞，以免疫沉淀檢測(cè)酪氨酸磷酸化