Smad3磷酸化對肺缺血再灌注損傷凋亡影響的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、肺臟是缺血-再灌注損傷的主要靶器官之一。肺缺血再灌注損傷常發(fā)生于肺移植及體外循環(huán)等術(shù)后。炎性反應(yīng)是肺缺血再灌注損傷的重要病理特征。炎性介質(zhì)如活性氧基團(tuán)、TNF-α和IL-1β的大量表達(dá)和釋放是誘導(dǎo)肺實(shí)質(zhì)細(xì)胞凋亡、引起肺功能下降的重要因素。細(xì)胞凋亡是一種程序性的，受多種因素(如各類細(xì)胞因子)調(diào)控的細(xì)胞死亡形式。目前大量的實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明細(xì)胞凋亡在肺缺血再灌注損傷過程中發(fā)揮著重要的作用。 轉(zhuǎn)化生長因子β1(TGF-β1)是一種多功能的細(xì)

2、胞因子，其作用存在多樣性。在動物實(shí)驗(yàn)證實(shí)TGF-β1能減輕或預(yù)防缺血再灌注損傷。而TGF-β的信號傳遞依靠膜受體以及其下級信號分子Smads。Smad3屬于Smads家族中的一員，是將轉(zhuǎn)化生長因子β1(TGF-β1)與受體作用的信號由胞漿傳導(dǎo)到胞核的中介分子。TGF-βⅠ型受體誘導(dǎo)Smad3磷酸化，磷酸化后的Smad3即pSmad3在細(xì)胞內(nèi)空間位置會發(fā)生改變，并轉(zhuǎn)移到細(xì)胞內(nèi)傳遞TGF-β1信號，調(diào)控目的基因的轉(zhuǎn)錄與表達(dá)。因此我們推測Sm

3、ad3磷酸化在肺缺血再灌注損傷中可能也扮演著重要角色。 本實(shí)驗(yàn)在建立穩(wěn)定的肺缺血再灌注損傷的大鼠模型的基礎(chǔ)上，重點(diǎn)評價Smad3磷酸化的作用。以TGF-β1以及Smad3磷酸化的抑制劑LY-364947為干預(yù)因素，用ELISA法測定肺組織磷酸化的Smad3即pSmad3濃度的變化，檢測肺組織缺血再灌注損傷后氧自由基水平和炎性介質(zhì)表達(dá)和釋放的變化，并用TUNEL染色檢測肺實(shí)質(zhì)細(xì)胞凋亡，以探討Smad3蛋白磷酸化在肺缺血再灌注中對肺

4、組織細(xì)胞凋亡的調(diào)控機(jī)制。 本研究分為兩個部分： 一、Smad3磷酸化在肺缺血再灌注損傷中對炎性介質(zhì)的影響 研究目的：炎性反應(yīng)是肺缺血再灌注損傷的重要特征?；钚匝趸鶊F(tuán)，腫瘤壞死因子-α以及白細(xì)胞介素-1β介導(dǎo)細(xì)胞凋亡，是肺缺血再灌注損傷的重要致傷因子。我們假設(shè)Smad3磷酸化可以抑制活性氧基團(tuán)，TNF-α以及IL-1β的表達(dá)和釋放并進(jìn)行驗(yàn)證。 研究方法：按Sekido'S的方法建立穩(wěn)定的原位單側(cè)肺缺血再灌注

5、的大鼠模型。40只SD大鼠隨機(jī)分為4組：假手術(shù)組(SO組，n=10)，缺血再灌注組(IR組，n=10)，TGF-β1組(T組，n=10)，阻斷劑LY-364947組(L組，n=10)。各組在在缺血再灌注10mins前均經(jīng)頸靜脈注射肝素100U/kg抗凝，T組同時注射TGF-β1(10ug/kg)，L組同時注射TGF-β1(10ug/kg)和LY-364947(1mg/kg)。左側(cè)肺缺血60mins后再灌注120mins，其中SO組不阻斷

6、肺門。麻醉期間用動物呼吸機(jī)支持呼吸，頻率70～80次/分，潮氣量1.5～2ml。再灌注結(jié)束后獲取肺標(biāo)本。用ELISA法測定組織勻漿的pSmard3濃度，并檢測SOD活力，TNF-α以及IL-1β的濃度。 研究結(jié)果：肺缺血再灌注損傷時Smad3磷酸化激活(48.482±19.602)，同時有大量的活性氧基團(tuán)產(chǎn)生，SOD活力明顯下降(15.499±3.487)。同時TNF-α和IL-1β大量表達(dá)(2.492±0.690，2.557±

7、0.542)。TGF-β1增強(qiáng)Smad3磷酸化的激活(63.607±17.194)，隨著pSmad3的增加，SOD消耗下降(22.441±3.909)，TNF-α和IL-1β表達(dá)被抑制(1.438±0.392，1.452±0.498)。LY-364947抑制Smad3磷酸化(13.763±8.732)，TNF-α和IL-1β表達(dá)增加(1.921±0.417，2.029±0.599)，SOD消耗增加，活力下降(18.892±3.176)。

8、 研究結(jié)論：活性氧基團(tuán)、TNF-α以及IL-1β誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，是肺缺血再灌注損傷的重要致傷因子。Smad3磷酸化至少部分傳導(dǎo)TGF-β1的作用，抑制活性氧基團(tuán)、TNF-α和IL-1β的產(chǎn)生和表達(dá)。Smad3磷酸化的作用可以被LY-364947阻斷。LY-364947抑制Smad3磷酸化，但是不能完全抑制TGF-β1的作用。 二、在肺缺血再灌注損傷過程中Smad3磷酸化對細(xì)胞凋亡的影響 研究目的：凋亡是肺缺血再灌注

9、損傷中細(xì)胞死亡的重要形式。在第一部分的研究中我們發(fā)現(xiàn)Smad3磷酸化可以抑制活性氧基團(tuán)，TNF-α以及IL-1β的表達(dá)和釋放。因此我們假設(shè)Smad3磷酸化減輕肺缺血再灌注損傷，抑制細(xì)胞凋亡。并對此進(jìn)行驗(yàn)證。 研究方法：建立穩(wěn)定的大鼠肺缺血再灌注損傷中的模型，40只SD大鼠隨機(jī)分為4組：SO組，IR組，T組和L組。各組在在缺血再灌注10mins前均經(jīng)頸靜脈注射肝素100U/kg，T組同時注射TGF-β1(10ug/kg)，L組同時

10、注射TGF-β1(10ug/kg)和LY-364947(1mg/kg)。在再灌注結(jié)束時獲取肺標(biāo)本分別制成組織切片和組織勻漿。用HE染色觀察肺組織損傷，TUNEL染色法檢測細(xì)胞凋亡。用ELISA法測定組織勻漿的pSmard3濃度。 研究結(jié)果：肺缺血再灌注損傷時Smad3磷酸化激活(48.482±19.602)。TGF-β1增強(qiáng)Smad3磷酸化的激活(63.607±17.194)，T組凋亡指數(shù)(10.500±4.127)予IR組相比