腦脈通聯(lián)合骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞移植對腦缺血再灌注大鼠神經(jīng)細(xì)胞中SYN-38和PSD-95的影響.pdf

1、　　背景
　　腦缺血損傷后神經(jīng)細(xì)胞變性、壞死是引發(fā)神經(jīng)功能障礙的關(guān)鍵。突觸結(jié)構(gòu)和功能的改變是腦功能重組重要的物質(zhì)基礎(chǔ),是神經(jīng)保護(hù)和修復(fù)最基本的單元。近年來,采取延緩腦缺血后神經(jīng)元損傷的進(jìn)程,挽救缺血半暗帶區(qū)未損傷的神經(jīng)細(xì)胞,促進(jìn)新的突觸結(jié)構(gòu)重建和神經(jīng)細(xì)胞的再生及修復(fù),成為研究缺血性腦血管病的熱點(diǎn)。骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(Bone marrow stromal cells,BMSCs)具有多向分化的潛能,經(jīng)外周血管移植入體內(nèi),與宿主細(xì)

2、胞具有很好的相容性,并隨著時(shí)間的推移向腦缺血灶不斷遷移,使缺血區(qū)的神經(jīng)細(xì)胞因子及相關(guān)蛋白表達(dá)增多,且缺血區(qū)相對應(yīng)的神經(jīng)功能也得到恢復(fù),顯示出良好的臨床應(yīng)用潛力。前期的臨床和實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果表明,減輕腦缺血損傷中具有顯著療效的腦脈通在促進(jìn) BMSCs 向缺血損傷半暗帶區(qū)移植,突觸結(jié)構(gòu)的重建和神經(jīng)元的再生修復(fù)方面表現(xiàn)出一定的優(yōu)勢。突觸素-38(SYN-38)和突觸后致密物質(zhì)-95(PSD-95)是突觸重建的標(biāo)志性蛋白,能較好的反應(yīng)突觸結(jié)構(gòu)重建和

3、神經(jīng)元的再生情況。鑒于上述,開展腦脈通聯(lián)合骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞移植對腦缺血大鼠神經(jīng)細(xì)胞中SYN-38和PSD-95的影響的研究具有重要的意義。
　　目的
　　1.以SD大鼠為研究對象,建立大鼠左側(cè)大腦中動(dòng)脈缺血再灌住損傷動(dòng)物模型,觀察腦脈通聯(lián)合骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞移植在 1w、2w、4w三個(gè)時(shí)間點(diǎn)對大鼠腦缺血損傷后腦組織病理變化的影響,探討腦脈通聯(lián)合 BMSCs 移植在大鼠腦缺血損傷后對腦組織的保護(hù)作用。
　　2.

4、采用免疫組化法檢測腦脈通聯(lián)合骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞移植對大鼠腦缺血損傷后 1w、2w、4w 三個(gè)時(shí)間點(diǎn)腦組織中 SYN-38 和 PSD-95 蛋白表達(dá)變化,探討腦脈通聯(lián)合 BMSCs 移植對腦缺血損傷后突觸結(jié)構(gòu)重建和神經(jīng)細(xì)胞再生修復(fù)的作用機(jī)制。
　　3.采用Western Blot法檢測腦脈通聯(lián)合骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞移植對大鼠腦缺血損傷后 1w、2w、4w 三個(gè)時(shí)間點(diǎn)腦組織中 SYN-38 和 PSD-95 活性變化,探討腦脈通聯(lián)合

5、BMSCs 移植對腦缺血損傷后突觸結(jié)構(gòu)重建和神經(jīng)細(xì)胞再生修復(fù)的作用機(jī)制。
　　方法
　　本實(shí)驗(yàn)選用190只3月齡(300±50)g雌雄各半的SD大鼠,將其按隨機(jī)數(shù)字表法三次隨機(jī)分組。一次：分為假手術(shù)組( A)與手術(shù)組,假手術(shù)組大鼠10只,手術(shù)組大鼠180只,手術(shù)組采用線栓法阻塞左側(cè)大腦中動(dòng)脈制作腦缺血再灌注損傷模型；二次：手術(shù)組根據(jù)干預(yù)方式分為模型組(B)、BMSCs移植組(C,簡稱移植組)、腦脈通組(D)、BMSC

6、s移植聯(lián)合腦脈通組(E,簡稱聯(lián)合組),各組大鼠45只；三次：每手術(shù)組根據(jù)取材時(shí)間點(diǎn)不同各分為 1w和2w及4w組,即模型組的B1w、B2w、B4w組,移植組的C1w、C2w、C4w組,腦脈通組的D1w、D2w、D4w組,聯(lián)合組的E1w、E2w、E4w；其中每組大鼠為15只。
　　1 運(yùn)用光鏡觀察模型組、腦脈通組、BMSCs移植組以及聯(lián)合組大鼠腦組織在1w、2w、4w的病理變化。
　　2 運(yùn)用免疫組化法檢測 SYN-3

7、8和PSD-95在模型組、腦脈通組、BMSCs移植組以及聯(lián)合組大鼠1w、2w、4w的蛋白表達(dá)變化。
　　3 運(yùn)用蛋白免疫印跡法(Western Blot)技術(shù)檢測SYN-38和PSD-95在模型組、腦脈通組、BMSCs移植組以及聯(lián)合組大鼠1w、2w、4w的蛋白活性變化。
　　結(jié)果
　　1 HE 染色光鏡下觀察腦脈通聯(lián)合骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞移植對腦缺血損傷后的病理變化的影響
　　假手術(shù)組神經(jīng)元胞體核膜、

8、核仁清晰,周圍無水腫,膠質(zhì)細(xì)胞完好,神經(jīng)纖維走形一致。血管內(nèi)壁光滑完整,管壁間隙小。模型 1w 組組織結(jié)構(gòu)輕度損傷。模型2w組大鼠缺血區(qū)神經(jīng)細(xì)胞核膜、核仁模糊,皮層神經(jīng)細(xì)胞損傷范圍較1w組擴(kuò)大,水腫程度加重,神經(jīng)纖維水腫程度加深,走行紊亂,部分膠質(zhì)細(xì)胞集聚,小壞死灶皮層下可見形成,血管結(jié)構(gòu)破壞,內(nèi)膜粗糙。模型4w組與模型組2w相比,水腫程度減輕,細(xì)胞壞死、變形減少；神經(jīng)纖維走行紊亂；血管管腔受壓、變形,可見周圍明顯水腫區(qū)域,皮層下可見不

9、同形態(tài)的壞死灶形成,破損的血管結(jié)構(gòu)較模型組2w相比修復(fù)可見,新生的毛細(xì)血管數(shù)量增加明顯。移植組1w大鼠的組織結(jié)構(gòu)改變與模型組1w相比不明顯；移植2w組大鼠神經(jīng)細(xì)胞壞死、血管水腫程度減輕,血管壁結(jié)構(gòu)較模型組2w完整,毛細(xì)血管豐富；移植4w組大鼠神經(jīng)細(xì)胞變形、壞死明顯減少,毛細(xì)血管與其 2w 組比較增多,血管周圍組織水腫減輕；腦脈通1w組較模型1w組相比,神經(jīng)細(xì)胞和血管周圍水腫程度減輕,神經(jīng)元細(xì)胞部分出現(xiàn)胞漿深染、神經(jīng)纖維輕度水腫,部分走行

10、清晰可見,血管結(jié)構(gòu)保持一定的完整性,血管內(nèi)皮細(xì)胞呈梭形分布；腦脈通 2w 組神經(jīng)細(xì)胞發(fā)生變性、壞死的程度較1w組減輕,與模型2w組相比,受損神經(jīng)細(xì)胞范圍減小,血管周圍可見少量的梗死灶形成,血管周圍輕度水腫,血管壁部分不完整,毛細(xì)血管增多；腦脈通 4w 組少部分神經(jīng)元胞體固縮、胞漿深染,神經(jīng)細(xì)胞周圍組織水腫改善,神經(jīng)纖維排列部分均勻,血管結(jié)構(gòu)內(nèi)膜修復(fù)可見,管周水腫減輕明顯,新生毛細(xì)血管較多。聯(lián)合 1w組神經(jīng)元細(xì)胞和膠質(zhì)細(xì)胞損傷程度較腦脈通

11、 1w組和移植1w 組減輕更明顯；聯(lián)合2w組與1w組相比,神經(jīng)細(xì)胞數(shù)量增多,神經(jīng)纖維排列走形基本一致,小血管豐富；聯(lián)合4w組比2w組改變更加顯著。
　　2 腦脈通聯(lián)合BMSCs移植對腦缺血大鼠神經(jīng)細(xì)胞中SYN-38和PSD-95蛋白表達(dá)的影響
　　實(shí)驗(yàn)二免疫組化研究結(jié)果：從整體上看,與假手術(shù)組比,SYN-38 表達(dá)在模型1w、2w和4w組均顯著降低(P<0.05)。模型1w、2w、4w組SYN-38的表達(dá)呈拋物線形,

12、2w表達(dá)到高峰,4w表達(dá)下降；移植、腦脈通、聯(lián)合2w、4w組SYN-38表達(dá)較其1w組增強(qiáng)(P<0.05)。與模型組相比,移植組、腦脈通組和聯(lián)合組各時(shí)間點(diǎn)SYN-38的表達(dá)均有所增高(P<0.01,P<0.05)。同一時(shí)間點(diǎn)相比,聯(lián)合1w、2w組和4w組SYN-38表達(dá)分別較移植組、腦脈通增高,4w最顯著(P<0.05)。PSD-95表達(dá)規(guī)律與SYN-38基本相似。
　　3 腦脈通聯(lián)合BMSCs移植對腦缺血大鼠神經(jīng)細(xì)胞中SYN

13、-38和PSD-95蛋白活性的影響
　　實(shí)驗(yàn)三Western Blot結(jié)果：與假手術(shù)組比較,PSD-95活性表達(dá)在模型組1w、2w 和 4w 減弱,隨著缺血再灌注時(shí)間的延長,減弱更顯著(P<0.01)；同一組內(nèi)各時(shí)間點(diǎn)的比較,模型組2w PSD-95活性表達(dá)較其1w增強(qiáng)(P<0.05),且達(dá)到高峰、4w呈下降趨勢；腦脈通組、移植組和聯(lián)合組2w和4wPSD-95活性表達(dá)較其組 1w 增強(qiáng),且呈逐漸增強(qiáng)趨勢,4w 活性最強(qiáng)(P<0

14、.05)；不同組間同一時(shí)間點(diǎn)比較,與模型組比較,移植組、腦脈通組和聯(lián)合組 1w、2w 和 4wPSD-95 活性表達(dá)均增強(qiáng)(P<0.01,P<0.05),且聯(lián)合組4w最強(qiáng)。SYN-38活性增強(qiáng)規(guī)律與PSD-95基本一致。
　　結(jié)論
　　腦脈通和 BMSCs 移植聯(lián)合應(yīng)用,能較好地減輕腦組織缺血損傷后的病理改變,促進(jìn)腦缺血大鼠神經(jīng)細(xì)胞中 SYN-38、PSD-95的蛋白表達(dá)及增強(qiáng)其活性,與時(shí)間遞增呈現(xiàn)出一種增強(qiáng)趨勢,且