Trihydrophobin1的酪氨酸磷酸化調(diào)控及核受體FXR在酒精性脂肪肝中的作用研究.pdf

1、基因在表達翻譯后形成蛋白質(zhì)，其氨基酸序列不再是其功能的唯一決定因素，翻譯后修飾在蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)功能成熟過程中發(fā)揮重要的調(diào)節(jié)作用。在應(yīng)對外界環(huán)境因素作用下，細胞內(nèi)大量的蛋白質(zhì)的功能實現(xiàn)是通過動態(tài)的翻譯后修飾來完成的。翻譯后修飾的作用賦予蛋白質(zhì)更加豐富信息，現(xiàn)已知的翻譯后修飾有上百種，研究蛋白質(zhì)翻譯后修飾對于闡明蛋白質(zhì)在維持機體正常生理過程以及預(yù)防治療相關(guān)疾病具有重要意義。本論文中我們研究了Trihydrophobin1的酪氨酸磷酸化在MAPK

2、/ERK信號轉(zhuǎn)導(dǎo)中的效應(yīng)以及核受體FXR的乙?；诰凭灾靖沃械淖饔茫醪疥U明翻譯后修飾在細胞正常生理過程中的復(fù)雜調(diào)控機制以及進行疾病模型中的轉(zhuǎn)化研究。
　　第一部分 Trihydrophobin1的酪氨酸磷酸化調(diào)控研究。c-Src是一種非受體型酪氨酸激酶，在細胞增殖、存活、黏附、形態(tài)形成以及細胞遷移中都發(fā)揮關(guān)鍵作用。在細胞內(nèi)c-Src持續(xù)活化促進細胞增殖和遷移。原癌基因c-Src的同源蛋白，v-Src，它為持續(xù)活化的激酶，并能

3、導(dǎo)致腫瘤形成。已經(jīng)在人類多種癌癥中發(fā)現(xiàn)的c-Src高表達及激酶活性增高。Trihydrophobin1(TH1)基因從果蠅到人類的種屬間都是高度保守，在心肌、骨骼肌、腎臟、腎上腺以及甲狀腺等多種組織中廣泛表達。TH1蛋白能夠特異性的與MAPK/ERK信號通路的分子A-Raf相互作用，并且抑制A-Raf蛋白的激酶活性，此外，TH1還能與和PAK1相互作用對其激酶活性負調(diào)節(jié)，并且能夠抑制MAPK/ERK信號傳導(dǎo)及細胞遷移過程。TH1在乳腺癌

4、中低表達，其表達水平與乳腺癌惡性程度成負相關(guān)，推斷TH1可能是一個抑癌基因。
　　盡管我們對TH1功能的理解已經(jīng)發(fā)展，但對TH1本身的功能調(diào)節(jié)還知之甚少。本課題中，我們通過免疫共沉淀，GST-pull down的方法鑒定了c-Src與TH1在細胞內(nèi)和體外均存在相互作用，這種相互作用依賴于c-Src的活化后結(jié)構(gòu)開放狀態(tài)。并且內(nèi)源性的c-Src與TH1也存在相互作用。通過激光共聚焦技術(shù)，我們觀察到細胞內(nèi)源性的c-Src與TH1在胞質(zhì)內(nèi)

5、存在共定位。在細胞內(nèi)及體外實驗中，我們又發(fā)現(xiàn)c-Src能夠磷酸化TH1，其酪氨酸磷酸化依賴于c-Src的激酶活性，采用c-Src的特異性抑制劑PP2幾乎完全阻斷了TH1酪氨酸磷酸化。通過缺失突變、點突變和生物信息學(xué)方法，我們鑒定了磷酸化位點位于TH1的第6位酪氨酸。磷酸化的TH1與A-Raf及PAK1的相互作用能力降低，進一步的實驗中我們發(fā)現(xiàn)TH1第6位酪氨酸的磷酸化減弱其對MAPK/ERK信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的抑制作用，對c-Src驅(qū)動的細胞遷移

6、的抑制作用也減弱了。TH1非磷酸化的突變體TH1(TH1-Y6F)依然能夠抑制MAPK/ERK信號轉(zhuǎn)導(dǎo)及c-Src驅(qū)動的細胞遷移，TH1模擬持續(xù)磷酸化的突變體則幾乎喪失了對MAPK/ERK信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的抑制作用以及對細胞遷移的抑制效果。此外，我們發(fā)現(xiàn)EGF及雌激素刺激情況下能夠誘導(dǎo)細胞內(nèi)源性的TH1酪氨酸磷酸化。綜上所述，我們推斷存在c-Src通過酪氨酸磷酸化TH1進而調(diào)控Ras/Raf/MEK/ERK信號轉(zhuǎn)導(dǎo)及細胞遷移過程機制。
　

7、　第二部分核受體FXR及其乙酰化在小鼠酒精性脂肪肝中的作用及相關(guān)機制研究。核受體FXR對維持肝臟正常生理功能至關(guān)重要，在糖代謝、脂代謝、膽汁酸代謝的調(diào)控起到重要作用。研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)XR缺失小鼠血糖、血脂、膽固醇異常升高?；罨疐XR能夠在膽汁淤積性肝病、非酒精性脂肪肝、肝纖維化等慢性肝臟疾病中保護肝臟免受損傷。
　　我們采用Lieber-DeCarli酒精液體飼料喂食小鼠構(gòu)建酒精性脂肪肝模型，同時采用FXR缺失小鼠以及灌胃給予小鼠FX

8、R激動劑WAY362450處理，研究FXR在小鼠酒精性脂肪肝進展中的作用。在酒精性脂肪肝小鼠中，我們首先檢測肝臟膽汁酸含量及相關(guān)代謝運輸基因表達水平，發(fā)現(xiàn)模型小鼠肝臟存在膽汁淤積，其膽汁酸含量較對照組顯著增高(33.69±4.144μmoles/g liver vs.14.56±1.02μmoles/g liver, p＜0.001);膽汁酸合成限速酶CYP7A1表達量在酒精組小鼠肝臟中表達亦增高，它的表達受到FXR的負調(diào)控，膽汁酸鹽輸

9、出蛋白BSEP的mRNA水平有一定程度降低，該基因受到FXR正調(diào)控。在兩組小鼠肝臟內(nèi)，F(xiàn)XR mRNA以及蛋白質(zhì)水平并無明顯差別，然而FXR與RXRα結(jié)合形成異二聚體的量明顯減少，由于FXR發(fā)揮轉(zhuǎn)錄活性依賴于與RXRα的相互作用。此外在酒精性肝病小鼠中，F(xiàn)XR的乙酰化水平升高。FXR乙?；瘯种破涠刍纬杉稗D(zhuǎn)錄活性，故我們推斷在酒精性脂肪肝中FXR活性受到抑制。
　　FXR缺失小鼠喂食酒精性飼料后，血清谷丙轉(zhuǎn)氨酶活性較野生鼠高(

10、111.01±15.94 IU/L vs.71.48±6.83 IU/L，p＜0.05)，肝臟中甘油三酯含量也比野生鼠高(136.8±10.7 mg/g liver vs.75.02±6.19 mg/g liver, p＜0.001)，肝臟HE染色顯示肝細胞脂肪變性和氣球樣變性比野生多，油紅O染色顯示甘油三含量較野生鼠豐富。相反，給予FXR激動劑WAY-362450處理后，能夠降低血清ALT水平(92.84±9.99 IU/L vs.6

11、0.91±7.18 IU/L，p＜0.05)以及肝臟甘油三酯含量(110.6±7.011mg/g liver vs.57.71±8.08 mg/g liver, p＜0.001)，而FXR缺失小鼠體內(nèi)給藥WAY-362450并無此效應(yīng)。肝臟HE染色和油紅O染色均顯示W(wǎng)AY-362450能夠降低野生型小鼠肝臟脂肪變性程度。
　　為了研究FXR治療酒精性脂肪肝的機制，我們首先檢測了酒精代謝相關(guān)基因的表達水平，CYP2E1受酒精刺激蛋白

12、表達水平明顯上升，其mRNA水平也明顯上升，若同時給予WAY-362450灌胃治療，小鼠肝臟CYP2E1蛋白和mRNA均明顯下降，酒精代謝引起的脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物TBARS以及4-HNE含量增高也在FXR激活后受到抑制。小鼠原代肝細胞內(nèi)CYP2E1水平能被FXR激動劑WAY-362450和GW4064抑制。我們的結(jié)果首次提出酒精代謝能夠影響肝臟膽汁酸代謝造成膽汁淤積，為酒精性肝損傷的另一可能機制。我們推斷FXR激動劑可以作為治療酒精性脂肪肝