Kupffer細胞的活化在急性酒精性脂肪肝發(fā)病中的作用.pdf

1、研究目的：
　　酒精是一種重要的肝臟毒物，過度飲酒會導致酒精性脂肪肝(alcoholic fatty liver，AFL)、酒精性肝炎、肝纖維化和肝硬化等一系列逐漸進展的肝臟疾病，即酒精性肝病(alcoholic liver diseases，ALD)。目前，ALD尤其是重度階段的ALD缺乏有效的治療方法。AFL因具有可逆性，故其是對ALD進行有效干預的最佳階段。探究AFL發(fā)病的分子機制可篩選出能有效防治ALD的潛在分子靶點。

2、r>　　Kupffer細胞（Kupffer cells，KCs）是肝臟內的常駐巨噬細胞，在多種肝臟疾病的發(fā)生和發(fā)展過程中起著重要作用。KCs被激活后，可釋放活性氧(reactive species oxygen，ROS)和炎癥介質如TNF-α(tumor necrosis factorα，TNF-α)等。研究證明，KCs在慢性ALD的發(fā)病中扮演著重要的角色，但關于KCs在急性AFL發(fā)病中的作用仍待闡明。本研究通過Binge Drinki

3、ng誘導的急性AFL小鼠模型和離體培養(yǎng)脂肪組織實驗，研究KCs特異性抑制劑三氯化釓(GdCl3)和TNF-α受體融合蛋白（益賽普）對急性AFL的拮抗作用，并從肝細胞內氧化應激、肝臟脂肪分解和合成代謝以及外周脂肪動員等方面進行分子機制探討。
　　研究方法：
　　1.動物實驗
　　SPF級雄性C57BL/6小鼠(18-22 g)50只，適應性飼養(yǎng)一周后，隨機分為對照組(Control)，模型組(Ethanol)和三氯化釓+

4、乙醇組(GdCl3/Ethanol)，益賽普+乙醇組(Etanercept/Ethanol)和N-乙?；腚装彼?乙醇組(NAC/Ethanol)組(n=10)。采用灌胃給予6 g/kg b.w.乙醇（連續(xù)給予3次，兩次間隔12 h）來誘導急性AFL。GdCl3、益賽普和NAC的劑量分別為10 mg/kg b.w.、1 mg/kg b.w.和100 mg/kg b.w.(i.p.)。在第一次乙醇暴露前24 h，GdCl3和NAC干預組小

5、鼠分別給予GdCl3和NAC;隨后在每次乙醇暴露前1h分別給予相應的藥物;對照組小鼠給予等能量的麥芽糖糊精溶液以及腹腔注射等體積等能量的生理鹽水溶液。末次酒精暴露6h后，小鼠摘眼球取血分離血清;隨后脫臼處死動物，迅速分離肝臟和附睪脂肪組織，分別用于病理學檢測、生化分析、蛋白電泳以及PCR半定量分析。
　　通過H&E染色和油紅O染色觀察肝臟組織病理學變化。采用試劑盒檢測血清丙氨酸氨基轉移酶(alanine transaminase，

6、ALT)和天冬氨酸氨基轉移酶(aspartate transaminase，AST)的活性，以及肝臟中甘油三酯(triglyceride，TG)、丙二醛(malondialdehyde，MDA)和一氧化氮(nitric oxide，NO)的含量。通過western blotting和qPCR技術測定PPAR-α(peroxisome proliferator-activated receptorα， PPAR-α)、 SREBP-1c(

7、sterolregulatory element-binding protein-1 c, SREBP-1 c)、 ACOX-1(acyl-CoA oxidase,ACOX)、FAS(fatty acid synthase, FAS)、ACC(acyl-CoA carboxylase, ACC)、硬脂酰輔酶A去飽和酶1（stearoyl-CoA desaturase，SCD-1）等調控脂肪代謝的分子蛋白和mRNA水平。
　　2.體

8、外實驗
　　SPF級雄性昆明小鼠(25-30 g)，斷頭處死，無菌條件下取出兩側附睪脂肪，用眼科剪剪成0.5-1 mm3大小的均勻顆粒，在細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)1.5 h后，加入不同濃度的TNF-α作用0.5-8 h，收集細胞檢測離體脂肪組織中激素敏感性脂肪酶(hormone-sensitivetriglyceride lipase，HSL)及其磷酸化水平，并檢測細胞培養(yǎng)液中游離脂肪酸(free fattyacid, FFA)的水平。<

9、br>　　研究結果：
　　1.GdCl3和益賽普對急性乙醇暴露導致的小鼠肝臟脂肪蓄積的影響:與對照組小鼠相比，模型組小鼠肝臟TG含量顯著增加(P＜0.05);與模型組小鼠相比，三種藥物干預組小鼠肝臟中TG含量分別減少了21.69％、20.88％和35.57％（P＜0.05）。病理學檢查可見模型組小鼠肝細胞中有大量大小不等的脂肪滴，而三種藥物干預組小鼠脂肪滴數(shù)量明顯減少。
　　2.GdCl3和益賽普干預對急性乙醇暴露引起的KC

10、s激活的作用:與對照組小鼠相比，模型組小鼠肝臟內F4/80蛋白和mRNA含量分別升高了309.0％和62.32％(P＜0.05)。與模型組小鼠相比，GdCl3+乙醇組小鼠肝臟內F4/80蛋白和mRNA含量分別降低了64.62％和52.40％(P＜0.05);而益賽普和NAC干預組小鼠肝臟內該蛋白及mRNA水平未見顯著改變。
　　3.GdCl3和益賽普對急性乙醇暴露引起的的小鼠肝臟氧化應激的影響:與對照組小鼠比較，模型組小鼠的NO和

11、MDA含量分別升高了45.35％和217.57％(P＜0.05)。與模型組小鼠相比，GdCl3+乙醇組、益賽普+乙醇組和NAC+乙醇組小鼠肝臟內NO和MDA水平分別降低了22.77％、28.86％和27.09％(P＜0.05)。
　　4.GdCl3和益賽普對急性乙醇暴露對小鼠肝臟中SREBP-1c調控的脂肪合成通路的影響:成熟形式的SREBP-1c(mSREBP-1c，68 kD)的蛋白含量在各組小鼠之間未見明顯變化。與對照組小鼠

12、相比，模型組小鼠肝臟內的ACC、FAS和SCD-1三者的蛋白含量顯著降低（P＜0.05）。與模型組小鼠相比，GdCl3+乙醇組小鼠肝臟ACC和FAS的蛋白含量進一步降低，益賽普+乙醇組小鼠肝臟ACC和FAS的蛋白含量有不同程度的增加，而NAC+乙醇組小鼠肝臟上述2個分子的蛋白含量無明顯改變。
　　5.GdCl3和益賽普對急性乙醇暴露對小鼠肝臟中PPAR-α調控的脂肪酸氧化分解代謝通路的影響:與對照組小鼠相比，模型組小鼠肝臟內的PP

13、AR-α和ACOX的蛋白和mRNA水平均顯著降低(P＜0.05)。與模型組小鼠相比，GdCl3和NAC干預組小鼠肝臟內PPAR-α和ACOX的蛋白和mRNA水平無明顯變化，而益賽普組小鼠肝臟內ACOX的蛋白含量顯著增加(P＜0.05)
　　6.GdCl3和益賽普對急性乙醇暴露對小鼠附睪脂肪組織脂肪動員的影響:與對照組小鼠相比，模型組小鼠脂肪HSL和p-HSL(p563、p565、p660)的蛋白含量均顯著增加(P＜0.05)。與模

14、型組小鼠相比，GdCl3和NAC干預組小鼠附睪脂肪HSL蛋白含量顯著降低（P＜0.05）;三種藥物干預組小鼠肝臟p-HSL563、p-HSL565和p-HSL660的蛋白含量有不同程度的降低。
　　7.TNF-α對體外培養(yǎng)的附睪脂肪動員的影響:TNF-α（10 ng/ml、作用時間1 h）可導致附睪脂肪組織中HSL及其磷酸化形式蛋白表達量明顯升高;隨著TNF-α作用時間的延長，該蛋白的表達量逐漸降低。在TNF-α暴露1h時間點，不