AQP9在非酒精性脂肪肝中作用機(jī)制的研究.pdf

1、目的：探討在油酸誘導(dǎo)的脂肪變性肝細(xì)胞模型中AQP9(Aquaproin-9)的表達(dá)和意義以及p38 MAPK(p38 mitogen-activtedprotein kinase)信號(hào)傳導(dǎo)通路對(duì)AQP9表達(dá)的調(diào)節(jié)作用及意義，進(jìn)一步探討AQP9在非酒精性脂肪肝中的作用及可能的調(diào)節(jié)機(jī)制。 方法：正常成人L-02肝細(xì)胞株，用含10％小牛血清的1640培養(yǎng)基傳代培養(yǎng)。采用免疫細(xì)胞化學(xué)方法觀察正常肝細(xì)胞株L-02中AOP9的表達(dá)部位。采用

2、MTT法摸索建立模型所需的最適宜的油酸濃度，并用該濃度的油酸誘導(dǎo)正常肝細(xì)胞株L-02建立肝細(xì)胞脂肪變模型。另外在模型組中加入p38 MAPK的阻斷劑SB203580。分為正常對(duì)照組(C組)，模型組(M組)，和阻斷劑組(B組)。當(dāng)油酸作用肝細(xì)胞24h、48h、72h后采用油紅O染色觀察細(xì)胞內(nèi)的脂滴的積聚情況。并檢測(cè)各組細(xì)胞內(nèi)TG、FFA、甘油含量。RT-PCR法檢測(cè)各組細(xì)胞內(nèi)AQP9 mRNA的表達(dá)變化。Western blot法檢測(cè)各組

3、細(xì)胞內(nèi)AQP9，總p38 MAPK，磷酸化p38 MAPK蛋白的表達(dá)變化。 結(jié)果：成功建立了油酸誘導(dǎo)的L-02肝細(xì)胞株脂肪變性的模型。油紅O染色光學(xué)顯微鏡觀察對(duì)照組細(xì)胞內(nèi)未見肝細(xì)胞脂肪變，細(xì)胞排列緊密，邊緣清晰，細(xì)胞核清晰可見。模型組在培養(yǎng)24h后可見少量脂肪變細(xì)胞，72h細(xì)胞內(nèi)聚集的脂滴數(shù)量最多，部分融合成較大的脂滴，脂肪變性程度最重。免疫細(xì)胞化學(xué)的結(jié)果顯示AQP9的陽性產(chǎn)物在正常肝細(xì)胞株L-02中表達(dá)比較豐富，主要位于肝細(xì)胞

4、的細(xì)胞膜上，而細(xì)胞漿和細(xì)胞核中無表達(dá)。M組和B組TG、FFA、甘油含量在各時(shí)相點(diǎn)較C組明顯增高(p＜0.01)。其中M組增高最為顯著，與B組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p＜0.05)。M組AQP9 mRNA和蛋白的表達(dá)均一致上調(diào)，與C組相比有顯著差異(p＜0.01)，B組AQP9 mRNA和蛋白較C組表達(dá)上調(diào)，但上調(diào)幅度低于M組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p＜0.05)。M組和B組p38 MAPK總蛋白較C組，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p＞0.05)，M

5、組磷酸化p38 MAPK蛋白較C組表達(dá)上調(diào)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p＜0.01)，B組中磷酸化P38 MAPK蛋白較C組無明顯變化(p＞0.05)，但表達(dá)顯著低于M組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p＜0.01)。 結(jié)論：采用油酸誘導(dǎo)L-02肝細(xì)胞株能夠成功制作培養(yǎng)的肝細(xì)胞脂肪變模型。在肝細(xì)胞脂肪變模型中AQP9隨肝細(xì)胞脂肪變性程度加重表達(dá)逐漸增加，阻斷p38 MAPK信號(hào)傳導(dǎo)通路后，AQP9的表達(dá)較模型組降低，肝脂肪變性程度降低，由此可見AQ