RhoA-ROCK介導(dǎo)的Moesin對(duì)磷酸化對(duì)晚期糖基化終產(chǎn)物作用下內(nèi)皮細(xì)胞反應(yīng)的調(diào)節(jié)作用.pdf

1、目的:該課題在本實(shí)驗(yàn)室前期研究基礎(chǔ)上,進(jìn)一步探討RhoA-ROCK介導(dǎo)的人膜突蛋白(moesin)磷酸化對(duì)晚期糖基化終產(chǎn)物(AGEs)引起的內(nèi)皮細(xì)胞形態(tài)和功能改變的調(diào)節(jié)作用。在前期研究中已經(jīng)證明了:1.AGEs通過誘導(dǎo)moesin磷酸化,導(dǎo)致內(nèi)皮細(xì)胞形態(tài)和功能的改變,進(jìn)而引起血管通透性增高。2.Rho激酶(Rhokinase,ROCK)參與了AGEs引起的內(nèi)皮細(xì)胞形態(tài)和功能的改變。因此本課題欲進(jìn)一步解決以下問題:1.驗(yàn)證Rho/ROCK

2、信號(hào)通路是否通過介導(dǎo)moesin的磷酸化,參與AGEs引起的內(nèi)皮細(xì)胞形態(tài)和功能的調(diào)節(jié)。2.進(jìn)一步探討Rho/ROCK信號(hào)通路引起moesin磷酸化的方式,是否通過直接與moesin作用導(dǎo)致其磷酸化。3.進(jìn)一步查明AGE/ROCK介導(dǎo)下moesin第558位蘇氨酸殘基(moesinT558)磷酸化在內(nèi)皮細(xì)胞形態(tài)和功能改變中的作用,為改善該病理過程提供切入點(diǎn)。
　　 本課題選用RhoA顯性負(fù)效突變體(RhoA N19)和組成型活性突

3、變體(RhoAL63)的重組腺病毒感染細(xì)胞,應(yīng)用G—LISA試劑盒檢測(cè)法檢測(cè)RhoA活性和免疫印跡技術(shù)檢測(cè)ROCK的磷酸化,并結(jié)合本實(shí)驗(yàn)室前期研究使用ROCK抑制劑處理細(xì)胞所得結(jié)果,進(jìn)一步明確Rho/ROCK通路是否參與了AGEs介導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞形態(tài)及功能的改變；通過免疫共沉淀技術(shù)檢測(cè)ROCK與moesin的相互作用,查明ROCK是否通過直接與moesin結(jié)合導(dǎo)致其磷酸化。通過分子克隆及體外定點(diǎn)突變技術(shù)分別構(gòu)建moesin的真核表達(dá)質(zhì)粒p

4、cDNA3/HA-moesin及其抑制型突變體pcDNA3/HA-moesinT558A和激活型突變體pcDNA3/HA-moesinT558D,經(jīng)脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞,經(jīng)實(shí)時(shí)熒光定量PCR、免疫印跡、單層內(nèi)皮細(xì)胞通透性的測(cè)定及內(nèi)皮細(xì)胞骨架纖維狀肌動(dòng)蛋白(filamentous actin,F-actin)形態(tài)和定位的檢測(cè),并結(jié)合本實(shí)驗(yàn)室前期研究結(jié)果,進(jìn)一步查明在AGEs誘導(dǎo)下moesin的具體磷酸化位點(diǎn)。本研究通過進(jìn)一步明確Rho

5、A/ROCK通路在AGEs導(dǎo)致的內(nèi)皮細(xì)胞功能變化中的作用,查明ROCK介導(dǎo)moesin磷酸化的方式和moesinT558位點(diǎn)的功能,探討AGEs引起的內(nèi)皮細(xì)胞功能變化的分子機(jī)制,有助于闡明糖尿病性微血管病變發(fā)生發(fā)展的機(jī)制,并為其治療提供新的思路。
　　 方法:AGE-HSA由人血清白蛋白與D-葡萄糖共孵育8周并過濾透析制得。體外培養(yǎng)人皮膚微血管內(nèi)皮細(xì)胞及人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞株,分別接種于微孔小皿(petridish)、雙層通透的培養(yǎng)

6、皿(transwell)頂層小室微孔膜上(直徑6.5 mm,孔徑大小0.4μm)、6 cm和10 cm細(xì)胞培養(yǎng)皿上,待細(xì)胞長(zhǎng)至融合或接近融合時(shí),換無血清培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)24 h,使細(xì)胞獲得同步生長(zhǎng),然后按實(shí)驗(yàn)分組分別處理備用。選用RhoA顯性負(fù)效突變體(RhoA N19)和組成型活性突變體(RhoA L63)的重組腺病毒感染細(xì)胞,應(yīng)用G-LISA試劑盒檢測(cè)法檢測(cè)RhoA活性和免疫印跡技術(shù)檢測(cè)ROCK的磷酸化；經(jīng)免疫共沉淀技術(shù)檢測(cè)ROCK與

7、moesin的相互作用；經(jīng)分子克隆及體外定點(diǎn)突變技術(shù)分別構(gòu)建moesin磷酸化位點(diǎn)突變的真核表達(dá)質(zhì)粒,抑制型突變體pcDNA3/HA-mocsinT558A和激活型突變體pcDNA3/HA-moesinT558D分別以丙氨酸和天冬氨酸替代蘇氨酸獲得,經(jīng)脂質(zhì)體預(yù)轉(zhuǎn)染內(nèi)皮細(xì)胞24 h,繼以AGE-HSA50 mg/L孵育。用免疫熒光染色法、激光共聚焦顯微鏡觀察細(xì)胞骨架肌動(dòng)蛋白F-aetin形態(tài)及分布改變；用免疫印跡技術(shù)檢測(cè)moesin的磷酸

8、化,采用多功能蛋白組學(xué)影像系統(tǒng)KODAK2000R直接成像,以Image J軟件分析各組灰度值,β—actin為內(nèi)參進(jìn)行校正,以對(duì)照組面積灰度值為100％與實(shí)驗(yàn)組進(jìn)行比較；用TRITC熒光標(biāo)記蛋白漏出法測(cè)定單層內(nèi)皮細(xì)胞的通透系數(shù)Pa值,實(shí)驗(yàn)結(jié)果以Pa變化百分比表示,Pa％=(實(shí)驗(yàn)樣品Pa值/對(duì)照樣品Pa值)×100。
　　 結(jié)果:
　　 1.AGE—HSA誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞RhoA活性增高
　　 (1)AGE-HSA以

9、時(shí)間和劑量依賴的方式引起內(nèi)皮細(xì)胞RhoA活性增高給予AGE—HSA刺激引起RhoA活性顯著增加,且呈時(shí)間(F=14.169,P=0.000)和劑量(F=8.405,P=0.000)依賴性。在時(shí)間效應(yīng)組中,隨著AGE-HSA作用時(shí)間的延長(zhǎng),細(xì)胞中RhoA活性逐漸增高,與對(duì)照組相比,從30 min分鐘起差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.002),至60 min時(shí),到達(dá)峰值,隨后RhoA活性開始緩慢下降,當(dāng)AGE—HSA作用120 min時(shí)與對(duì)照組相

10、比差異仍有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.000)。劑量效應(yīng)組中,隨著AGE-HSA濃度的增加,內(nèi)皮細(xì)胞細(xì)胞中RhoA活性逐漸增多,當(dāng)AGE—HSA濃度達(dá)N25 mg/L時(shí),與對(duì)照組相比,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.008),隨著AGE-HSA濃度增加,RhoA活性持續(xù)增加,當(dāng)達(dá)N50 mg/L時(shí),RhoA活性達(dá)到峰值(P=0.000),當(dāng)達(dá)到100 mg/L時(shí),RhoA活性開始下降,但與對(duì)照相比,仍有顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.001)。結(jié)果提示:

11、AGE-HSA能引起內(nèi)皮細(xì)胞RhoA活性的增高,并呈時(shí)間和劑量依賴性。
　　 (2)L63和N19重組腺病毒對(duì)AGE-HSA介導(dǎo)的RhoA活性變化的影響與對(duì)照組相比,給予AGE-HSA刺激后,RhoA活性明顯增高(P=0.000),轉(zhuǎn)染組成型活性突變體(RhoA L63)后,RhoA活性也明顯增高(P=0.000),轉(zhuǎn)染RhoA顯性負(fù)效突變體(RhoA N19)后可下調(diào)RhoA的活性(P=0.000),而先轉(zhuǎn)染顯性負(fù)效突變體(R

12、hoA N19)24 h后,然后再和AGE-HSA作用,則明顯抑制了AGE-HSA引起的RhoA活性增高(P=0.000)。
　　 (3)L63和N19重組腺病毒對(duì)AGE-HSA介導(dǎo)的ROCK磷酸化的影響與對(duì)照組相比,給予AGE-HSA刺激ROCK磷酸化水平明顯增高(P=0.001),轉(zhuǎn)染組成型活性突變體(RhoA L63)后ROCK磷酸化水平也明顯增高(P=0.001),而先轉(zhuǎn)染RhoA顯性負(fù)效突變體24 h后,再給予AGE—

13、HSA50 mg/L刺激1 h后,ROCK磷酸化水平較AGE-HSA組下降(P=0.019)。結(jié)果提示:AGE-HSA通過激活RhoA導(dǎo)致ROCK磷酸化,下調(diào)RhoA活性可以抑制AGE—HSA誘導(dǎo)的ROCK磷酸化。
　　 (4)L63和N19重組腺病毒對(duì)AGE-HSA介導(dǎo)的moesin磷酸化的影響給予AGE-HSA刺激及轉(zhuǎn)染組成型活性突變體(RhoA L63)后,moesin磷酸化水平明顯增高(P=0.000),先轉(zhuǎn)染RhoA顯

14、性負(fù)效突變體(RhoA N19)24 h后,再給予AGE-HSA50 mg/L刺激1 h后,moesin磷酸化水平較AGE組下降(P=0.001),提示下調(diào)RhoA活性可以抑制AGE誘導(dǎo)的moesin磷酸化。結(jié)果提示:下調(diào)RhoA活性可以抑制AGE-HSA誘導(dǎo)的moesin磷酸化。
　　 2.內(nèi)皮細(xì)胞內(nèi)源性ROCK與moesin的相互作用提取內(nèi)皮細(xì)胞總蛋白后,以moesin特異性抗體免疫沉淀后,再以ROCK特異性抗體做免疫印跡檢

15、測(cè),結(jié)果在有或無AGE-HSA刺激的條件下,均可檢測(cè)到ROCK,分子量大小與陽(yáng)性對(duì)照組相同,而陰性對(duì)照組未檢測(cè)到。再以ROCK特異性抗體免疫沉淀后,以moesin特異性抗體做免疫印跡檢測(cè),結(jié)果同樣在有或無AGE-HSA刺激的條件下,均可檢測(cè)到moesin。提示在正常情況下細(xì)胞內(nèi)源性ROCK與mocsin存在于一個(gè)復(fù)合體中,因此本研究進(jìn)一步檢測(cè)了p-ROCK與moesin的相互作用,以p-ROCK特異性抗體免疫沉淀后,再以moesin特異

16、性抗體做免疫印跡檢測(cè),結(jié)果顯示在給予AGE-HSA刺激后,moesin的條帶與無AGE-HSA刺激時(shí)明顯減少。我們推測(cè)moesin與p-ROCK的結(jié)合減少,可能是moesin被磷酸化激活后脫離復(fù)合體而履行其連接蛋白的功能。
　　 3.成功構(gòu)建moesin磷酸化位點(diǎn)突變質(zhì)粒并在內(nèi)皮細(xì)胞中表達(dá)經(jīng)分子克隆及體外定點(diǎn)突變技術(shù)構(gòu)建moesin磷酸化位點(diǎn)突變的真核表達(dá)質(zhì)粒,抑制型突變體pcDNA3/HA-moesinT558A和激活型突變體

17、pcDNA3/HA-mocsinT558D分別以丙氨酸和天冬氨酸替代蘇氨酸獲得。經(jīng)脂質(zhì)體預(yù)轉(zhuǎn)染內(nèi)皮細(xì)胞24 h,分別提取細(xì)胞總RNA和總蛋白,實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)結(jié)果顯示轉(zhuǎn)染pcDNA3/HA-moesinT558A的內(nèi)皮細(xì)胞moesin mRNA表達(dá)與對(duì)照組相比明顯增高(P=0.001),轉(zhuǎn)染pcDNA3/HA-moesinT558D的Inoesin mRNA表達(dá)與對(duì)照組相比也明顯增高(P=0.000),免疫印跡結(jié)果顯示轉(zhuǎn)染pcDN

18、A3/HA-moesinT558A和pcDNA3/HA-moesinT558D的內(nèi)皮細(xì)胞均可檢測(cè)到HA-moesin的表達(dá),而未轉(zhuǎn)染組未檢測(cè)到。結(jié)果提示:構(gòu)建了moesin磷酸化位點(diǎn)突變質(zhì)粒,并在內(nèi)皮細(xì)胞中成功表達(dá)。
　　 4.轉(zhuǎn)染pcDNA3-HA—moesinT558A和pcDNA3-HA-moesinT558D質(zhì)粒對(duì)AGE-HSA介導(dǎo)的moesin磷酸化的影響與對(duì)照組相比,單獨(dú)給予AGE-HSA刺激(P=0.001)或單獨(dú)

19、轉(zhuǎn)染激活型突變體pcDNA3-HA-moesinT558D(P=0.002),moesin磷酸化水平均升高。而轉(zhuǎn)染抑制型突變體pcDNA3-HA-moesT558A后,再給予AGE-HSA50 mg/L刺激1 h,moesin磷酸化水平較單獨(dú)給予AGE-HSA刺激組相比明顯下降(P=0.015)(圖16)。結(jié)果提示:pcDNA3-HA-moesinT558A能抑制AGE-HSA刺激誘導(dǎo)的moesin磷酸化,而pcDNA3-HA-mocs

20、inT558D則模擬了AGE-HSA刺激誘導(dǎo)的moesin磷酸化。
　　 5.轉(zhuǎn)染pcDNA3-HA-moesinT558A和pcDNA3-HA-moesinT558D質(zhì)粒對(duì)AGE-HSA介導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞通透性改變及細(xì)胞骨架肌動(dòng)蛋白F-actin形態(tài)及分布變化的影響
　　 (1)轉(zhuǎn)染pcDNA3-HA-moesinT558A和pcDNA3-HA-moesinT558D質(zhì)粒對(duì)AGE-HSA介導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞通透性改變的影響單獨(dú)給

21、予AGE-HSA刺激內(nèi)皮細(xì)胞通透性較正常對(duì)照組明顯增高(P=0.000),單獨(dú)轉(zhuǎn)染激活型突變體pcDNA3-HA-moesinT558D后,內(nèi)皮細(xì)胞通透性較正常對(duì)照組組也明顯增高(P=0.000),而預(yù)先轉(zhuǎn)染抑制型突變體pcDNA3-HA-moesinT558A,后給予AGE-HSA刺激,能夠顯著抑制AGE-HSA誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞高通透性(P=0.000),但仍未達(dá)到正常水平。而預(yù)先轉(zhuǎn)染激活型突變體pcDNA3-HA-moesinT558

22、D,后給予AGE-HSA刺激,能促進(jìn)AGE-HSA引起的內(nèi)皮細(xì)胞通透性增高。結(jié)果提示:pcDNA3-HA-moesinT558A能抑制AGE-HSA刺激誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞高通透性,而pcDNA3-HA-moesinT558D則模擬了AGE-HSA刺激誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞高通透性,并與AGE-HSA刺激有協(xié)同作用。
　　 (2)轉(zhuǎn)染pcDNA3-HA-moesinT558A和pcDNA3-HA-moesinT558D質(zhì)粒對(duì)AGE-HSA介導(dǎo)

23、的內(nèi)皮細(xì)胞細(xì)胞骨架肌動(dòng)蛋白F-actin形態(tài)及分布變化的影響正常情況下,內(nèi)皮細(xì)胞骨架F-actin主要分布在細(xì)胞周邊,線條完整連續(xù),顯示出內(nèi)皮細(xì)胞的典型鵝卵石樣輪廓,單獨(dú)給予AGE-HSA刺激或單獨(dú)轉(zhuǎn)染激活型突變體pcDNA3-HA-moesinT558D后,均可見F-actin在胞漿內(nèi)彌散分布,形成非極性單行排列的應(yīng)力纖維,而預(yù)先轉(zhuǎn)染抑制型突變體pcDNA3-HA-moesinT558A,后給予AGE-HSA刺激,可見F-actin仍

24、主要分布在細(xì)胞周邊,但F-actin外周致密帶不如正常組規(guī)整連續(xù),相對(duì)彌散,但無明顯應(yīng)力纖維形成,與AGE-HSA組相比,有明顯改善。結(jié)果提示:pcDNA3-HA-moesinT558A能抑制AGE-HSA刺激誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞細(xì)胞骨架肌動(dòng)蛋白F-actin形態(tài)及分布變化,而pcDNA3-HA-moesinT558D則模擬了AGE-HSA刺激誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞細(xì)胞骨架肌動(dòng)蛋白F-actin形態(tài)及分布變化。
　　 結(jié)論:
　　 1

25、.AGE-HSA以時(shí)間和劑量依賴的方式引起內(nèi)皮細(xì)胞RhoA活性增高。
　　 2.AGE-HSA通過激活RhoA活性進(jìn)而導(dǎo)致其下游靶分子ROCK的磷酸化,并通過直接與moesin相互作用激活moesin,最終導(dǎo)致內(nèi)皮細(xì)胞形態(tài)和功能的改變。
　　 3.AGE/ROCK介導(dǎo)下的moesin蛋白是通過第558位蘇氨酸殘基(moesinT558)磷酸化,進(jìn)而發(fā)揮其在內(nèi)皮細(xì)胞形態(tài)和功能改變中的作用,抑制該位點(diǎn)的磷酸化可改善這一病理過